PCR室作业指导书

文件编号：ABCD-3-PR-01~31

第A版

编制：

审核：

批准：

生效日期：2006年8月8日

ABCD人民医院检验科

编  制  说  明

本分册文件可以作为单独申请卫生部PCR实验室认可的全套作业文件，因此作为ISO15189质量管理体系的PCR室作业文件，要对其重复部分进行删减，各检验科根据各自用途要求与特点进行选用，特此说明。

                                              2006年8月8日

目    录

  修 订 页

PCR实验室的设置及管理

1．目的：建立实验室的合理设置和科学管理，防止实验污染，保证检测结果的可靠性。

2．适用范围：本程序适用于分子诊断室的设置、工作流程和日常管理等。

3．负责人：

4．细则：

4．1 分子诊断室为检验科下设的专业实验室，从事临床标本的基因扩增检测及相关科研工作。

4．2 本实验室采用实时荧光定量PCR技术作为临床基因诊断的主要手段，实验室分为三个区：试剂准备区（第一区）、标本处理区（第二区）、扩增分析区（第三区）。每一工作区配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服，并有明显的区分标识。各区标签颜色：红色（第一区）、白色或绿色（第二区）、蓝色（第三区）；专用工作服：粉红色（第一区）、白色（第二区）、蓝色（第三区）。标本的接收则在检验科标本接收处进行。

4．3 各工作区专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等，不可混用。

4．4 各工作区配置、功能和内务管理见各相关SOP文件。

4．5 严格遵守从“试剂准备区→标本处理区→扩增分析区”的单一流向制度，不得逆向进入前一工作区。

4．6 非本实验室工作人员，未经许可不得入内；进修、实习或其他科室人员因科研活动需要，进入实验区域（试剂准备区、标本处理区、扩增分析区）需首先熟悉本程序的各项规定并严格遵守执行，在本实验室人员监督指导下进行。

4．7 实验完毕后做好清洁消毒工作。

5. 本文涉及以下图表：

1.实验室设计平面图

PCR实验室工作制度

1．目的 ：保持良好的工作环境，以确保检测结果的可靠性，防止交叉污染，防止差错、事故及纠纷的发生。

2．适用范围：所有本实验室人员。

3．负责人：

4．细则：

4．1 本实验室进行临床基因扩增检测及相关实验工作，不得进行其它实验操作。

4．2各区的用品不得混用。

4．3在各区的实验操作过程中，操作者必须戴手套和帽子，严格按照操作规程。

4．4试剂准备区只能进行试剂的贮存及配制等相关操作（见相关SOP文件）。

4．5标本处理区只能进行临床标本的保存，核酸提取、保存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成（见相关SOP文件）。

4．6扩增分析区只能进行DNA或cDNA的扩增、实时荧光PCR扩增产物的分析（见相关SOP文件）。

4．7进行实验时严格执行本实验室的各项操作规程，及时做好各种操作记录，力求准确、可靠。实验完毕，做好清洁、整理及分析统计等工作。

4．8室内仪器由专人负责，未经许可，不得随意使用或挪用；爱护使用仪器，定期进行保养与维修。

4．9 爱护医院财产，注意安全；离开实验室前应关好门窗，检查水、电等。

PCR实验室内务管理制度

1．目的：保证实验室日常内务管理及清洁工作顺利进行。

2．适用范围：实验室相关人员及医院相关清洁工人。

3．负责人：

4．细则：

4．1非本室工作人员未经允许不得进入实验室。

4．2各区的用品不得混用。

4．3实验人员要有强烈的时间观念，按时上下班，不迟到、早退。

4．4进入实验室的工作人员必须遵守实验室的单一流向的规定，禁止逆向走动。

4．5所有仪器（如PCR扩增仪）须有专人负责，并有使用维护记录；实验人员必须熟悉仪器性能后方允许操作，并严格遵守操作规程。

4．6所有试剂进购、配制、质检、使用均要有记录，未经允许不得随意带出本实验室。

4．7每天了解仪器运转情况及试剂使用情况，确保仪器整洁安全，试剂合格使用。

4．8各区的各种清洁消毒均应有记录，工作衣消毒时注意各区应分开进行处理。

4．9注意保持实验室卫生整洁，严禁在室内抽烟、吃零食，非实验操作人员应尽量少入。4. 10下班前检查门、窗、水、电，节假日应指定人员负责检查实验室的仪器、设备。

PCR实验室人员的配置及管理

1．目的：保证实验室有足够数量的合格的具备开展该类实验能力的实验人员。

2．适用范围：适用于实验室人员配置、管理、培训及考核。

3．负责人：

4．细则：

4．1   人员要求

4．1．1   本实验室工作人员应为医学检验专业或相关专业毕业，具有中级以上技术职称或专科以上学历。

4．1．2    实验室工作人员应参加卫生部或省临检中心举办的PCR技术培训，并取得合格证。

4．1．3    对于新进入本室的人员，如尚未取得PCR技术培训合格证，应在实验室有培训合格证的上级技术人员的指导下进行实验工作，实验报告由有资格人员出具，并应在最短的时间内取得上岗培训合格证。

4．2   人员配置

4．2．1   实验室应根据工作需要配备足够的工作人员，目前实验室有主管技师2人、技师1人，3人都已获得培训合格证，视工作量的增加和业务发展需要，会适当增加工作人员。

4．2．2   各级技术人员履行相应的工作职责。

4．3   人员培训及考核

4．3．1   实验室负责人或负责人指定人员参加每年卫生部PCR室间质评总结会。

4．3．2   实验室工作人员每1～2年至少参加1次PCR技术的省级或国家级继续教育项目，参加相关学术交流会议。

4．3．3   安排未取得上岗培训合格证的工作人员在合适的时间内参加技术培训。

4．3．4  科室不定期组织实验室内部实验人员学习、更新核酸扩增方面的相关知识，提升自身的理论学习水平。特别是在标本接收区采血、接收标本的人员，需定期对其进行有关核酸扩增技术，标本采集、保存、运输等知识的培训。一些科室的送检标本由该科室的人员送到标本接收区，对这些临床医护人员也要定期进行有关核酸扩增技术，标本采集、保存、运输等知识的培训。

4．3．5  本实验室工作人员每年进行考核一次,考核内容:

a)日常工作质量

b)室内质控测评

c)室间质控测评

d)在抱怨处理中的表现

 4．3．6  本实验室工作人员实行严格奖惩制度,有下列表现者可受奖:

a)工作质量高, 质控测评成绩优秀者

b)有科研能力,并有一定数量和质量的论文发表

c)有独创性工作成果,经鉴定认可者

d)受到有关部门或群众嘉奖者

有下列情况者将受到惩处:

a)工作质量问题较多，质控测评成绩不合格；

b)不遵守规章制度并造成一定影响；

c)不求上进。

4．3．7  本实验室工作人员奖惩方法分精神及物质两类,经实验室上报医院及有关部门批准后执行。

4．3．8 本实验室工作人员均建立业绩档案,实行能进能出制度,不断吸收高质量人员,加强培训和提高,对于不适合本室工作的人员要及时调离。

4．4   人员管理

4．4．1 实验室建立所有工作人员的技术档案，包括：学历、任职资格、发表论文、研究成果、培训等相关材料复印件。

4．4．2  技术档案分文本档案和电子档案，文本档案每年更新1次，电子档案随时更新。

5. 本文涉及以下表格

实验室主要负责人简历表        

PCR实验室工作人员一览表        

培训申请表                      

  年度培训计划表                   

培训记录表                      

员工培训履历表                   

人员档案卡                       

PCR实验室清洁程序

1．目的：保证实验室环境的整洁，防止污染。

2．适用范围：适于实验室工作环境、实验台面、工作服、移液器等的清洁消毒工作。

3．负责人：        操作人：

4．细则：

4．1 实验室地面必须平整、干净，通道要利于通行，没有无用的物品阻碍。

4．2 合理规划实验室内物品，做到摆放整齐、有序，无用的或使用效率低的物品放置到储存处，常用的物品要容易寻找到。

4．3抽屉、柜子、文件类物品要作好标记，以方便识别。

4．4 实验结束后用2%戊二醛对台面进行清洁，并用移动紫外灯进行消毒。

4．5每天对使用过的移液器用75%酒精进行擦拭。每周1次对移液器咀进行75%酒精浸泡15分钟左右，若使用过程中发生污染应随时浸泡处理。

4．6实验过程中如发生标本或试剂外溅，应立即用2%戊二醛滴上，滤纸盖上半小时，然后用酒精擦洗，并用移动紫外灯消毒。

4．7 每天实验前开启各区的通风系统，各区实验结束后，分别打开传递窗紫外灯、移动紫外灯（对实验台面消毒）、天花板紫外灯消毒实验室，每次开启 30～60分钟。

4．8 待紫外灯消毒时间足够后，依次关闭各区紫外灯并记录。

4．9 依次清洁三个区的实验台面和地面，各区清洁消毒工具均专用，不可混用，注意按照单一方向流程的原则来进行清洁。

4．10 处理好各区废弃物，交医院集中处理。

4．11 每周将工作服交院洗衣房洗涤消毒，不同实验区的工作服隔开洗涤。

5. 本文涉及以下表格

实验室清洁消毒记录表          

垃 圾 处 理 记 录 表          

PCR标本唯一标识编号规则

1．目的：保证标本编号的唯一性，也是准确发放报告的基础。

2．适用范围：使用核酸扩增荧光检测实验室所开展的四种检测项目：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、结核杆菌、沙眼衣原体。

3．负责人：       操作人：

4．程序：

4．1 按检测日期分类标记

根据标本送检的日期，每天的标本对应标记一种唯一的代号。如当天为2005年3月1日，则编为050301。

4．2 按检测类型分类标记

根据检测项目的不同，每种检测项目对应标记一种唯一的代号。如乙型肝炎病毒标记为B，丙型肝炎病毒标记为HC，结核杆菌标记为T，沙眼衣原体为C。

4．3 按验单接收顺序编号

在同种检测类型的验单中，按验单顺序编号。如第一个检测乙型肝炎病毒的验单编为B01，第二个检测乙型肝炎病毒的验单编为B02，第三个检测结核的验单编为B03等。

4．4 特殊标本的编号

如有特殊情况，应在标记前面增加特异字母区别开，如住院的单和门诊的单、其它医院送来的单和本医院的单要区分开等。

4．5 编号步骤

a）对当天送来的标本，根据编号的基本原则编号，每个样本的每个检测项目对应一个唯一的编号（如050301T04）。

b）   用笔在每张检验申请单和对应的样品管上作好相同的标记。

c）   做好标本的接收记录，每个样本的记录都应包括以下信息：接收时间、医院、科室、送检医生、患者姓名、性别、年龄、标本类别、标本状态、送标本者、接收人、检验单号、标本唯一统编号等。

d）处理好样品、点样后，将反应管放入扩增仪上开始扩增。

f）扩增得到结果后，先在统计簿上填入结果，作好记录，再一一把实验结果填入相应申请单。

g）发放检验报告单。

5. 本文涉及以下图表：

PCR扩增接收标本记录表    

PCR基因扩增实验室的要求

1．目的：规定在各区内所进行的工作及其操作。

2．适用范围：所有在本区内进行的工作。

3．负责人：      操作人：

4．程序：

实验室分四区:标本接收区；试剂贮存、准备区；标本制备区；扩增区。进入各区严格按照单一方向进行，即试剂贮存、准备区——标本接收区——标本制备区——扩增区。各区及其设备、物品必须有明确的标记，严禁混用。

进入PCR实验室的工作人员（含卫生员），都必须遵守实验室的规则，尤其严格遵守进入PCR实验室的唯一流向。不可进入PCR扩增后区打扫卫生，再返回扩增前区工作。防止非本室工作人员串岗，进入本室。尤其不得为找人，而逆向误入PCR实验室。

总则

（1）       PCR实验室工作人员应具备医学检验、微生物检验基本知识，大专以上学历，并受过PCR实验的基础知识和技能培训。

（2）       PCR实验室分试剂准备，样本准备，PCR扩增和产物检测四个室，各室的实验物品（含加样器，试管架，吸头，记录纸，笔等），不得混用，须贴上标签予以区别。

（3）       实验室技术人员必须严格按照PCR实验室操作程序进行，包括实验室擦洗。台面消毒，离心管，吸头的无菌灭活准备，仪器使用和废弃物处理等。

（4）       进入实验室的工作人员必须更换各室不同的工作服（含帽和鞋），勤换洗工作服，以及遵守实验室的唯一流向的规定，严禁反向流动。

（5）       进入PCR实验室后区的物品不许带进PCR实验室前区。每天实验开始前，必须清洁地面和消毒实验室前区。实验结束应紫外线消毒实验台面，产物分析室紫外灯最好彻夜开启，排风扇应昼夜工作。每天下班前处理好废物，应关好水、电、煤气和门窗。

（6）       定期校准和维修PCR仪、酶标仪及离心机、水浴箱等仪器设备。

（7）       实验室内不得饮食、吸烟。

4.1标本接收区

4.1.1实验人员进入该区须穿本区白色工作服，接收标本须戴一次性手套。

4.1.2记录实验室干、湿度，绘制冰箱温度图。使用带有本区标识的记录本、纸和笔，每项记录，书写工整详细。

4.1.3对送检的标本实行双签制度，并仔细检查是否符合检测要求，对有不符合要求的标本及时通知相关科室重新采样，并作记录，每份标本需给出唯一性编号。

4.1.4本区所有废弃物分类装入垃圾袋，封好，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，将垃圾带出实验室。

4.1.5每次实验结束后，清洁实验台及地面打开紫外灯消毒30分钟。记录紫外灯使用情况。

4.2试剂贮存、准备区

4.2.5使用带有本区标识的记录本、纸和笔，每项记录，书写工整详细。

4.2.6准备好的试剂送入下一区 ，还原实验台面，将本区所有废弃物分类装入垃圾袋，封口，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，将本区垃圾带出实验室。

4.2.7白色工作服留在本区。

4.2.8本区维持相对正压状态（开启缓冲区的排气扇）。实验结束后，清洁实验台及地面打开紫外灯消毒30分钟。

4.3标本制备区

4.3.1实验人员进入该区须在缓冲区更换专用蓝色工作服及拖鞋。实验中须使用一次性帽子，戴手套，手套在实验过程中疑有污染应立即更换。

4.3.2将传入本区的试剂放入冰箱冷冻室试剂存放专区暂存。记录实验室干、湿度，绘制冰箱温度图。

4.3.3将冰箱内二周前的标本密封丢入垃圾筐，然后记录标本的保存情况。

4.3.4使用带有本区标识的记录本、纸和笔，每项记录，书写工整详细。

4.3.5按试剂盒说明书对标本进行处理，将处理好的标本在超净工作台内加样，记录标本的处理过程。

4.3.6将加样后的试剂传送下一区，还原实验台面，关闭所有仪器，记录仪器使用时间和运行状态。

4.3.7使用过的离心管、吸头须置于盛有10％84液的废液缸中，实验结束后方丢入垃圾袋，患者样品应按有生物传染性危险品对待。

4.3.8将本区所有废弃物分类装入垃圾袋，封口，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，将垃圾带出本区。

4.3.9将蓝色工作服留在本区。

4.3.10本区应避免不必要的走动，同时维持相对正压状态，实验结束后，清洁实验台及地面打开紫外灯消毒30分钟。

4.4扩增产物检测区

4.4.1实验人员进入该区须在缓冲区更换专用粉色工作服及拖鞋。

4.4.2记录实验室干、湿度，绘制冰箱温度图。

4.4.3使用带有本区标识的记录本、纸和笔，每项记录，书写工整详细。

4.4.4将传入本区加样后的试剂上机扩增。

4.4.5扩增完成后，记录检测结果，及时发放报告单，记录仪器使用时间和运行状态。

4.4.6将本区所有废弃物分类装入垃圾袋，封口，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，然后将垃圾带出实验室。

4.4.7将粉色工作服留在本室再离开实验室

4.4.8严禁本区物品带至其他区，该区需维持负压状态，排气扇24小时排气，实验结束后清洁该区打开紫外灯照射，最好整夜消毒，记录紫外灯使用情况。

5. 本文涉及以下表格

PCR实验室环境温湿度记录表        

冰箱温度质控图                    

实验室清洁消毒记录表              

垃 圾 处 理 记 录 表             

紫外消毒车消毒记录表              

PCR废弃物的处理程序

1．目的：保证实验室、实验人员和外部环境的安全。

2．适用范围：核酸扩增荧光检测实验室常用化学试剂（NaOH、EDTA、乙醇、生理盐水等）、实验室废弃物的处理；

3．负责人：        操作人：

4．细则：

4.1科室职责应对本室工作人员讲明本程序在预防交叉、实验室污染及切断传播途径中的重要性，并要求严格执行。

4.2实验室所有垃圾，装入专用污物袋内，各区备有：生活垃圾袋（黑色）及生物污染垃圾袋（黄色）。使用过的一次性消耗品(如试管、吸头、离心管、等)，先放入10%次氯酸钠溶液中浸泡2～4小时后，再放入黄色垃圾袋内，使用过的手套、鞋套等直接放入黄色垃圾袋内交医院集中处理。

4.3 夹取标本的工具，如钳、镊、接种环、吸管等，用后均应消毒清洁，进行微生物检验时，应重新灭菌，金属工具可烧灼灭菌或消毒液浸泡；玻璃制品干热或压力蒸汽灭菌。

4.4 一次性塑料痰盂，用2%戊二醛液浸泡2～4小时后，放入黄色垃圾袋内交医院集中处理。

4.5 废弃标本如血、尿、胸水、腹水、脑脊液、唾液、胃液、肠液、关节腔液等用10%的84液浸泡2～4小时后，交医院集中处理。

4.6 盛标本的容器，若为一次性使用的纸质容器及其外面包被的废纸，放入污物袋里交医院处理；对可再次使用的玻璃、塑料或搪瓷容器，煮沸15分钟或加入10%次氯酸钠溶液浸泡2～4小时，消毒液每日更换，消毒后用洗涤剂及流水刷洗，沥干，用于微生物培养采样者，用压力蒸汽灭菌后备用。

4.7 废弃标本及其容器装入黄色垃圾袋内、封闭，交医院污物处理中心处理。

4.8日常生活垃圾如纸屑等按一般垃圾交医院处理。

5. 本文涉及以下表格

PCR废血标本处理交接表                

基因扩增检测实验及结果分析

1、目的：保证扩增及结果分析的标准化、规范化。

2．适用范围：适用于本室使用的普通离心机。

3．负责人：肖静  操作人：胡可存  蒋艺勤

4、标准程序：

4.1 基因扩增检测标准程序：扩增反应前须先在样本输入模板上按照事先排好的标本位置进行设置。每次实验除待检标本，还需包括：阴性对照、阳性对照、室内质控品各一份，一组阳性标准品（4个梯度10⁸、10⁶、10⁵、10⁴）。

4.1.1打开电脑电源开关，进入Windows NT界面。

4.1.2 接着打开PCR仪电源开关，预热5分钟。 

4.1.3双击电脑桌面的ABI Prism 5700 SDS Software图标进入程序设置界面。

4.1.4单击 “文件”菜单中的 “新建”命令，（或单击工具栏中的“新建”按扭）。在测定、容器和模板中做相应的选择，点击OK。

4.1.5应用检测管理程序，并将其添加到样品板文档中。

4.1.6检测反应管，

4.1.7 根据当次实验所需条件编辑时间和温度。运行样品板文档。

4.2 结果分析标准程序 ：

应按以下步骤进行：全部曲线——阴性对照——阳性对照——阳性室内质控品——阳性标准品——逐个分析（标出阳性标本和可疑标本）——调整参数，获得较好的标准曲线，显示定量结果——登记，发报告。

4.2.1 整体曲线的观察：将所有曲线选中进行整体观察

1）观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），特别应注意大量曲线

在同一Ct值出现上涨的情况。

2）观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。

4.2.2 阴性对照的分析

阴性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阴性标本。

作用：用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染。

4.2.3 阳性对照的分析

阳性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阳性标本。

作用：用以监测实验能否正常检出阳性标本，避免假阴性的出现。

4.2.4 室内质控品的分析

室内质控品：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知浓度室内质控品。

作用：用以监控日常实验的精密度。

4.2.5 阳性标准品的分析

1）各梯度曲线的分布是否均匀，若各梯度曲线均未分开，则表明阳模稀释可能存在问题，提示实验中存在较大人为误差。

2）观察各曲线的Ct值是否在平日的正常位置。

情况1：若出现低拷贝标准品做不出，而各曲线Ct 值均后移，则判断是否为试剂扩增效率下降（如试剂过期或保存条件不合格）。

情况2：出现低拷贝标准品做不出，而高拷贝曲线Ct值均正常，则提示可能存在低拷贝阳性标准品的降解情况。

3）每日必做10⁴标准品，用作以下三方面监控：一是否存在操作误差，如加样量过少等原因导致10⁴标准品未能检出；二是否存在稀释后的梯度放置过久，低拷贝标准品降解的情况；三是若高拷贝标准品出现Ct值后移，且能排除情况1、2，则判断是否为试剂灵敏度下降。

4.2.6 单个曲线的判断：逐个分析每条曲线，判断曲线的阴阳性或属可疑曲线。（可疑标本是指曲线在25个Ct值后出现上涨且平台趋势不明显或上涨幅度比较低的标本。可疑标本要第二天重做，两次结果一致则报阳性，否则结果报阴性。）

曲线观察内容：在基线选择2～8时观察荧光强度（是否有三期特征）。并分别在Delta Rn vs.Cycle 、Ct vs.Well Number和 Rn vs.Cycle这三种扩增图形式下分析数据。

4.2.7 得出定量结果：调节基线和阈值以得到一较好的标准曲线。电脑据此曲线给出阳性结果值。此时应排除某些阴性标本因荧光曲线假性上扬而得出的假阳性结果和某些弱阳性标本因终末荧光值过低而显示的假阴性。

4.2.8 发放报告：及时登记检测结果记录，发放临床报告。

4.3实验结果无效的判断标准：出现下述四种情况中的任何一种或多种，当次实验结果不可发，查找原因，重做实验。

4.3.1 阴性对照出现扩增。

4.3.2 阳性对照无扩增。

4.3.3大批甚至所有的标本都扩增了。

4.3.4 室内质控血清检测结果出现失控情况，实验失控的具体标准详见室内质控标准操作程序。

4.4实验结果有效的判断标准：达到下列要求后，当次实验有效，可以发放结果。

4.4.1阴性对照没有扩增，阳性对照扩增。

4.4.2阳性标准品梯度曲线平滑均匀，斜率、截距和相关系数三个参数的数值均在范围内。

4.4.3室内质控血清检测结果处于在控状态，具体标准详见

5. 本文涉及以下表格

室间质评记录表                        

PCR室内质控记录表                  

室内质控图                         

临床标本的保存操作程序

1．目的：临床标本正确保存，以便必要时复查。

2．适用范围：分子诊断室的所有临床检测标本。

3．负责人：       操作人：

4．程序：

4．1 处理前的标本保存

a）HBV：全血标本可4℃下短期（24h内）保存，长期保存则需分离出血清（血浆），保存于-20℃下。

d）HCV：在1小时内分离血清，吸取200µl，加入20u Rnasin，保存于-20℃。尽可能快的提取RNA。

c）TB：痰或胸腹水、脑脊液、脓液标本用于TB检测的短期保存可置于4℃下，长期保存则于-20℃下。

d）CT：标本短期（24h内）保存置于4℃下，长期保存则需在-20℃下。

4．2 报告发出后的标本保存：

a） 提取的核酸标本当天检测可置4℃保存，如当天不检测应置-20℃保存。报告发出后第二天丢弃。

b） 原始血清/血浆样本在报告发出后放入低温冰箱-20℃保存1个星期，以备复查。超过1个星期保存期的标本由室负责人酌情处理，一般按生物传染性物品交医院统一处理。

c）血清/血浆标本放置低温冰箱保存时须有记录，按编号顺序存放，并由专人负责管理。

4．3 特殊标本的处理：

对暂不检测的项目和规定时间外收到的零散样本，要随时登记和交班，以免漏检，遗失和延误检验。对特殊样本或特殊病人的样本，实行“首接”负责制，所谓特殊样本是指难于采集的样本，以及特殊病人的样本一律实行“首接”负责制，无论那位工作人员，一旦收到样本后，均须负其责任，不得以任何借口推托，及时和正确保管和转送样本到有关实验室或有关人员，同时作交班记录和双签名。对于做长期病情动态考察的病人标本一律置于-20℃下长期保存，使用时再按需取出检测。

5. 本文涉及以下图表：

PCR扩增接收标本记录表                  

拒收标本记录本                         

标本超低温保存记录表                 

临床标本的采集、运送、接收程序

1．目的：规范临床待检标本的正确采集、送检和处理。

2．适用范围：分子诊断室的所有临床检测标本。

3．负责人：      操作人：

4．程序：

4．1 标本的采集

4．1．1 标本由临床各科室接受过临床基因扩增检测有关标本采集、保存、运输知识培训的医护人员采集并送至实验室。

4．1．2标本采集要求

a）血液标本：用2ml真空采集管或1.5ml高压灭菌离心管采集血液标本，血标本采集后在2小时内送达实验室（HCV采用EDTA抗凝的血浆）。离心（检验单与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的1.5ml的离心管中，编号。

b）痰标本：用带盖的无菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰标本送检。（对于无痰或少痰的患者，可用45℃加温的100g/L NaCl水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出；对于小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集标本。）标本在室温下保存不能超过24小时。

c）生殖道拭子：尿道或阴道分泌物由医生用专用取样拭子（灭菌，一次性）采集样本，及时送检。采集生殖道拭子标本，要求男性病人在采样前2小时内不能排尿，采样时，将棉拭子伸入男性尿道及女性宫颈口2～3cm，转动一周以获得上皮细胞。

d）尿液：由病人自留尿液于无菌封闭的杯中送检。

e）脑脊液和胸腹水：由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检。

注意：所有上述用于临床标本采集的容器如试管或离心管，均应使用前高压灭菌和密封。

4．2 标本的运送

标本采集后，密闭、标（贴）姓名，应尽可能快的送至检测实验室，如运送时间需2小时以上，必须用冰盒送至实验室。

标本中如加入了适当的稳定剂，如用于RNA测定加入4mol/L异硫氰酸胍盐（GITC）的血清（浆）标本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄。

4．5 接收

4．5．1严格对各类样本的查对和双签制度，对病房各样本及时进行验收，查对，不符合要求的样本一律退回，并有书面记录。

4．5．2 分类验证

4．5．2．1 一般内容

进入实验室的样本在进行编号、离心前，工作人员应再次认真查对姓名，联号，住院号，病区床号，项目等。对不符合要求者应作记录，并及时通知采样科室，正确及时地补采样，以免延误病人的检测结果报告。对书写不清楚的申请单，当事者要及时与病房联系(可电话)，明确受检者姓名，住院号，性别，年龄，病区，床号和检验项目等；并作相应记录。

4．5．2．2  按检测项目验证标本

a）HBV：所需标本类型为未溶血的血清或血浆，注意血浆标本所用的抗凝剂，用EDTA-K₂，不可使用肝素。标本为全血时应及时分离出血浆保存。

b）HCV：同上，但标本为血清时，要在1小时内分离出血清用于检测。

c）TB：晨起第一口深部痰(不能为唾液)、胸腹水、脑脊液、脓液或穿刺液。

d）CT：尿道或阴道分泌物。

4．5．2．3 实验室人员对标本进行查验，出现下表中不合要求的情况时，应拒收标本，登记并告知相关科室。

4．5．2．4 拒收程序

a）对拒收的不合格标本应在拒收标本记录本上登记。

b）填写不合格标本处置单，并随同申请单送返送检科室。

c）必要时电话告之相关科室医生或护士。

5.  本文涉及以下图表：

PCR扩增接收标本记录表          

PCR扩增拒收标本记录表         

PCR生物安全防护措施

1．目的：预防工作人员在实验过程中被感染或污染。

2．适用范围：适用于本室所有工作人员。

3．负责人：     操作人：

4．细则：

4．1  实验人员在实施生物防护措施时，应严格遵守各项相应的规章制度，建立起强烈的生物防护意识。

4．2  每天更换废液缸的2%戊二醛溶液，并保证2%戊二醛溶液用量为废液缸内总液量的五分之一左右。配置消毒液时，正确量取足量的消毒剂（用量杯，保证浓度），水的用量也要正确，缸体密封性良好。

4．3  实验台面日常清洁时使用75%的酒精擦拭。

4．4  每区每次实验后紫外灯照射30～60分钟，如有需要可延长照射时间。

4．5  所有来自病人的血液或体液标本均应视作传染源，因此在标本的采集、运输过程中，标本容器应完好无泄漏。

4．6  处理标本时应穿工作服、戴手套，以免沾上皮肤。如手或其它部位的皮肤沾上血液或体液标本以及试剂，应立即冲洗干净。有下列情况之一者，需另外消毒：手接触有传染性的微生物，水龙头、水池肥皂可能被污染，工作服可能被大量细菌污染。消毒剂可用“84”消毒液。

4．7  在实验过程中，病人标本（血液、体液）或试剂不慎溅入眼内应立即用清水洗。

4．8  实验过程中在使用针具等锐器时，尽量小心防止受伤。若被锐器刺破时，应立即脱下手套，尽量挤压伤处，使血流出，然后用碘酒、酒精消毒，必要时进行预防补救措施。

4．9  在实验过程中病人标本（血液、体液）外漏时，应立即用2%戊二醛滴上，滤纸或纱布盖上半小时，然后用酒精擦洗，并用紫外灯消毒。

4．10 实验完毕离开时，应脱下所有该实验区个人防护装备。

4．11 实验完毕后应对实验室进行紫外消毒。

4．12 遇有意外事故应立即报告科室负责人，当事人应立即注射相关疫苗或进行预防性治疗，并进行医学观察，严重者应报告院技术负责人。

5. 本文涉及以下表格

紫外消毒车消毒记录表         

实验室清洁消毒记录表         

PCR实验室化学试剂配制程序

1．目的：保证实验中用到的各种溶液符合实验要求。

2．适用范围：核酸扩增荧光检测实验室常用溶液：4%NaOH溶液、75%酒精、消毒剂（三氯异氰尿酸或 二氯异氰尿酸钠）、2%戊二醛溶液等。

3．负责人：      操作人：

4．程序：

4．4 化学试剂的配制：

4．4．1 用具：干燥洁净的250ml量桶一只，1000ml量桶一只，1000ml烧杯一只，三角烧瓶两只，天平一架，100ml塑料试剂瓶、2000ml广口瓶各一只。

4．4．2 配制步骤：

4．4．2．1 配制4%NaOH溶液:

a）用天平称取4克分析纯的NaOH固体，置于一只三角烧瓶中。

b）用250ml量桶准确取100ml水，缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中。

c）摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解。

d）然后缓缓倾倒入100ml塑料试剂瓶中密封保存备用。

4．4．2．2 配制消毒剂:

a）一般桌面、器具和地面的消毒只要使有效氯达到500mg/L，即可达到消毒作用。

b）消毒剂为粉状（20克/袋），如配制一升的消毒剂溶液，则取500g，倒入烧杯中，缓缓加入1000ml水充分溶解，备用。

c）如需加大消毒力度，则有效氯浓度加大。

4．4．2．3 配制75%酒精溶液:

a）一般常规消毒的75%酒精由医院药剂科提供。

b）RNA提取的75%酒精的配制，试剂盒提供DEPC水，酒精用分析纯的无水酒精，根据当天的标本数量进行配制。

4．4．2．4 配制2%戊二醛溶液:

a）准确量取戊二醛原液20ml倒入1000ml烧杯中。

b）量取980ml水，缓缓倒入1000ml烧杯中，混匀，加至2000ml广口瓶中备用。

注意事项：每份配制好的溶液保质期为14天

PCR实验室记录管理制度

1、目的：确保检验资料的记录、保存状态在控

2、适用范围：实验过程中产生的数据、文本资料的记录

3．负责人：         操作人：

4、工作程序：

4.1  书面记录文件的管理：

4.1.1 本实验室的书面记录包括：

001 ABCD人民医院检验科基因检测实验室平面图------------编号ABCD/001

002实验室主要负责人简历表-----------------------------编号ABCD/002

003PCR实验室工作人员一览表----------------------------编号ABCD/003

004PCR扩增接收标本记录表------------------------------编号ABCD/004

005拒收标本记录本-------------------------------------编号ABCD/005

006标本超低温保存记录表-------------------------------编号ABCD/006

007PCR试剂购买记录表----------------------------------编号ABCD/007

008试剂验收记录表-------------------------------------编号ABCD/008

009PCR室特殊耗材验收记录表----------------------------编号ABCD/009

010普通耗材验收记录表---------------------------------编号ABCD/010

011室间质评记录表-------------------------------------编号ABCD/011

012PCR室内质控记录表----------------------------------编号ABCD/012

013室内质控图-----------------------------------------编号ABCD/013

014 PCR实验室环境温湿度记录表-------------------------编号ABCD/014

015冰箱温度质控图-------------------------------------编号ABCD/015

016仪器使用记录表-------------------------------------编号ABCD/016

017仪器设备维护和校准记录表---------------------------编号ABCD/017

018紫外消毒车消毒记录表-------------------------------编号ABCD/018

019应急处理登记表-------------------------------------编号ABCD/019

020 PCR废血标本处理交接表-----------------------------编号ABCD/020

021垃圾处理记录表-------------------------------------编号ABCD/021

022实验室清洁消毒记录表-------------------------------编号ABCD/022

023 PCR检验报告单-------------------------------------编号ABCD/023

024耗材进购记录表-------------------------------------编号ABCD/024

025试剂耗材供应商一览表-------------------------------编号ABCD/025

4.1.2 填写书面记录，需使用黑色墨水或圆珠笔，字迹清晰，如有涂改，在涂改处应有涂改人签名，不得在记录表上进行无关书写，保持记录表清洁、完整。实验记录表严格专用，不同实验区不得混用。

4.1.3 每个记录本要纳入档案管理，写完后及时放入档案柜，每月分类装订成册,并依照要求进行编号,如2003年5月的实验结果记录本、试剂消耗记录本、室内质控图分别编为200305SYJG、200305SJXH、200305SLZK，分别放于档案柜的不同位置以便查询。标本原始检测申请单最后保存于仓库2年，其它实验记录保存于各自实验操作区内，保存5年。

4.1.4 定期对保存的记录进行分析总结，形成总结报告，以便改进工作。

4.1.5 在没有实验室职责同意的情况下，不得随意将记录借出。在记录借出时需有实验室职责、经手人、借阅人的签名方可。

4.2 电脑上记录文件的管理

4.2.1记录文件必须保存在非系统分区中，如D盘，保存路径要清晰、便捷、易查找。

4.2.2文件夹目录结构要求层次分明，一整年的实验结果均保存在一个年度文件夹里，如“2003年”文件夹；每个年度文件夹包含12个月文件夹，如“Jan01”、“Feb02”，每天的实验结果就保存在当月文件夹里。

4.2.3 实验文件保存时以当天日期命名，若某天进行了多, 次实验，命名时在后面以a、b、c等字母标识，如2003年5月8日做的两次实验，分别保存为20030508a和20030508b。

4.2.4为了防止储存实验结果的电脑发生系统崩溃、硬件故障等问题导致实验结果丢失、无法查询等情况，每个月的实验结果记录文件都要用移动存储设备（如软盘、USB硬盘等）拷贝到另一部PC机上做备份；一年的数据要用刻录机刻制一张CD光盘备份储存，贴上标签，如“2003年实验结果备份”,放入档案柜妥善存放。

PCR应急处理程序

1．目的：在实际工作中，仪器设备发生故障、试剂盒发生质量问题时，为保证检验结果的准确性、及时，应正确采取应急措施，最大程度上避免或减轻不利影响。

2．适用范围：适用于满足核酸扩增荧光检测实验室检测需要并可能对检验结果造成误差的仪器设备和试剂盒。

3．负责人：

4．细则：

4．1 核酸扩增荧光检测实验室工作人员在职责范围内均有责任熟悉各种仪器和相关设备的性能、要求、维护和保养、常见故障的排除、尤其要严格按照操作规程操作。

4．2 工作人员在职责范围内均有责任有意识地注意以求及时发现并报告仪器设备和试剂盒的异常情况。

4．3 作为应急处理，潜在着一定的可能影响检测质量的不确定因素。室负责人负责在第一时间检查核实应急措施的有效性。

4．4 仪器设备故障

4．4．1 室负责人接到异常情况报警后，立即现场确认异常情况的性质：观察有误、误操作、偶发现象或确属不能立即排除的故障。

4．4．2 用红牌故障标志标示故障仪器，以防被错误使用。

4．4．3有满足要求的替用设备的，启用替用设备（准用仪器）。借用其他部门仪器设备时，及时联系借用并核实该设备的使用状态。替用、借用或备用设备的使用在满足质量要求的同时，必须同时满足实验室管理措施（特别是防污染）的要求。

4．4．4不能解决的问题，应及时与供应方会同解决。根据双方合同约定，及时通知供应方。供应方技术支持人员将在规定的时间内随身携带备用设备到达现场。

4．4．5仪器维修后，必须经验收合格并供需双方签字，调试实验通过后才能重新启用。取下红色故障标示（暂停使用），换上蓝色正常标示（正常使用）。

4．4．6 室主任须检查并随时跟踪所采取措施的有效性。

4．4．7对未能及时排除故障时，必须及时上报科室，在科主任批准下，应积极联系附近的其他已得到卫生部临检中心认证的临床基因扩增检验实验室检验，以满足病人和临床或科研需求。

4．5 试剂盒质量发生问题，经核实后，及时通知供货商迅速更换另一批次试剂，使用前需先作质量检测，合格后方可使用。

4．6 仪器设备故障或试剂质量问题不能得到解决，预期将会影响到检测报告的及时发出，可将标本送至其它已得到卫生部临检中心认证的临床基因扩增检验实验室检查；如已影响到报告的及时发出，应在门诊取报告处向病人公告或向相关病区公告，取得病人的谅解。

4．7  影响到检测报告发出的情况，应在应急处理记录表作记录。

5. 本文涉及以下表格：

应急处理记录表        

试剂的质检标准操作程序

1．目的：保证每批用于临床实验的试剂的质量良好，符合要求。

2．适用范围：各种用于临床实验的核酸扩增荧光检测试剂（HBV、HCV、TB、CT）。

3．负责人：      操作人：

4．程序：

4．1 收到试剂后，目测试剂是否处在冻存状态。

4．2 核对试剂品种和数量并检查包装：外包装（厂名厂址、、批准文号、批号和有效期等）；内包装（试剂瓶完整性、试剂配备品种完整性、使用说明书有否等）。

4．3 及时将试剂转入－20℃冰箱保存。将上述检测核对情况在记录本上登记。

4．4 最迟在前批次试剂存量尚可维持常规实验一周时，按如下要求对新批号试剂进行效验实验。

4．5 效验实验：

4．5．1 要求设置：空白对照、阴性对照、阳性对照、室内质控各一，阳性标准品梯度（10⁴、10⁵、10⁶、10⁸）。

4．5．2 出现如下情况中任何一种的，判断为试剂不合格，不能用于临床检测：

a）空白对照出现扩增。如扩增曲线CT值大于25，需重复实验确证试剂污染。

b）阳性对照和阳性标准品均未检出，或阳性对照未检出而阳性标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。

4．5．3 阳性对照未检出，阳性标准品检测正常，提示样品提取液可能存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。更换提取液后该批试剂方可使用。

4．5．4 空白对照无扩增，阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。单独用提取液点样上机，出现扩增，需更换提取液后方可使用该批试剂。

4．5．5 阳性对照检出，阳性标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT值偏大5个循环以上。提示阳性标准品存在问题。更换阳性标准品后该批试剂方可投入使用。

4．5．6空白对照、阴性对照无扩增，阳性对照正常检出，阳性标准品导出的标准曲线之斜率（－2.9～－3.9）、截距（26～34）、相关性（﹤－0.99）均在使用范围内，表明该批试剂良好，可以投入临床使用。

4．6 将实验结果归入记录。

5.      本文涉及以下图表

PCR试剂购买记录表         

试剂验收记录表

PCR消耗品进购、质检、贮存程序

1、目的：保证实验消耗品的质量、合理配用及存放

2、范围： 1.5ml离心管、0.5ml离心管、带滤芯的吸头

3．负责人：        操作人：

4、程序：

4.1实验人员按需提出所购耗材的品名、规格、数量，交科主任审核，报相关部门订货及购买。

4.2 消耗品进购后经质检合格方可入仓，填写消耗品进购、质检记录表。

4.3无菌处理前的消耗品贮存于试剂贮存、准备区，定期领取消毒并作用量记录，消毒过的消耗品送标本制备区备用。

4.4消耗品在使用过程中发现质量问题（如畸形、离心管密闭性不好等），立即通知科主任，科主任报相关部门，办理退、换货手续。

5、质检

5.1  0.5ml、 1.5ml离心管

5.1.1   目测:检查离心管有无畸形、破损、不能闭盖的情况。

5.1.2   实验检测：

（1）目测合格后，随机抽取50个离心管用于实验检测。

（2）离心管置于干式恒温器中20分钟后取出，如发现有爆开情况发生，即认为该批离心管不符合本实验室实验要求，作退货处理。

（3）再将这50个离心管加半量生理盐水后，10000rpm离心20分钟，如发现有管盖爆开或漏液情况发生，即认为该批离心管不符合本实验室实验要求作退货处理。

（4）用6个离心管做平行对照实验，是否与预期结果一致。

（5）经上述检测合格后，即启用该批耗材。

5.2  检测带滤芯的吸头

5.2.1 目测：检查吸头有无畸形、破损，是否带有滤芯。

5.2.2   实验检测：

（1）目测合格后，随机抽取50个吸头用于实验检测。用适配加样器配合吸取适量液体，检查有无吸孔堵塞、漏气现象发生，在排除移液器因素后，如有异常发现，即认为该批吸头不符合本实验室实验要求，作退货处理。

（2）用10个滤芯吸头做平行对照实验，是否与预期结果一致。

（3）经上述检测未发现不合格情况后，即启用该批耗材。

6.  本文涉及以下图表

耗材进购记录表                       

PCR室特殊耗材验收记录表               

普通耗材验收记录表                   

PCR室内质量控制标准操作程序

1．目的：随时了解并控制实验室检测的精密度变化。

2．适用范围：核酸扩增荧光定量检测实验室。

3．负责人：       操作人：

4．程序：

4．1血清质量控制品制备及操作

4．1．1质控品制备：

收集本室检测的临床样本，HBV DNA定量为10⁶copies/ml的样本混匀，并分装于0.5ml的离心管中，每支110µl，编号后（如Qb0201-n），-20℃保存。

4．1．2 操作：

每次检测过程中将此分装的室内质控品与样本同时检测，记录此标本的检测结果；计算前10次检测结果的平均值作为本批质控品的靶值。

4．1．3如果使用商品化的质控品，按4．１．２要求执行。

4．2 室内质控图的使用方法

4．2．1 描点

a） 图中 线为靶线， ±2s为警告线， ±3s为失控线。

对于同一批号的质控血清不论使用几个月，其空图均不变化。只要将图纸上方“起止日期”项填入每个月的实际起止日期即可。

b） 每天将该批号质控血清按有关规定程序复融随同病人的标本同时检测。将日期、检测结果和操作者如实记录在图下方的相应位置，并按前面的方法画出图上的对应点，用直线将该点与前一天的点连接。

c）月底计算当月全部质控血清检测结果的 、s和CV，并进行图形分析和小结，将质量控制图存入质控资料档案。

4．2．2 图形分析

a）如果在 ±3s线以外，则为失控，应立即报告有关负责人，迅速查找原因。必要时复测标本，然后方可发出报告，并将失控情况、查找过程及处理结果等详细记录。

b）如果在 ±2s线以外，或出现连续6点以上在一侧等规律变化，均应即使向有关负责人反映，并积极查找原因。但当天的检验结果一般可以发出。

4．2．3 通过观察图形的规律性变化进行误差分析，消除误差来源

a）曲线漂移：提示有系统误差，准确度发生了一次性的向上或向下改变。这种变化往往是由于一个新的情况引起的。如更换不同批号试剂，启用新批号的质控血清、操作人员的变换等。在找原因时，应重点注意“漂移”前后发生了那些变动的因素。

b）趋势性变化：向下或向上的趋势性变化表明检测的准确度发生了渐渐地变化。这种变化往往是由于一个逐渐改变的因素造成的。如质控血清的降解，试剂效价的降低等。

c）连续多点分布在靶值一侧：目前，一般认为质控血清的检测结果连续6天以上

出现在靶值同一侧，则应迅速查找原因，争取尽快使之回复围绕在靶值随机分布的状态。因为按照统计学原理，由纯随机误差造成的这种情况的可能性很小。连续6天以上出现在靶值同一侧可能性小于1.5％。因此凡出现连续6天以上出现在靶值同一侧者均有可能存在非随机误差因素。如结果与靶值偏离并不太大，不会给临床使用带来太大影响时，一般检验报告可以照常填发。

d）其他规律变化：（周期性等）

4．2．4 通过图形的资料对比进行误差分析，消除误差来源

a）每个月的月底将该月的全部质控血清检测结果的 和s与该批测定的 和s进行比较。如果 发生了变化，说明准确度发生了变化提示有非随机误差存在。如果当月s不同则表明检测的精密度发生了变化。

b）将使用同一批号质控血清的CT值的 和s按月份列出。如果 逐月上升， 应考虑保存不当造成的试剂效价降低或质控血清本身出现降解。如果各月份 基本一致而s逐月加大，则主要提示常规工作的精密度下降，应重点从操作、管理上找原因。

c）在数年中，把每个月的CV和失控规律列成表，可用作检测质量的历史性回顾及趋势分析。

5. 本文涉及以下图表：

PCR室内质控记录表          

室内质控图                

PCR室间质量控制操作程序

1．目的：室间质评（EQA）是实验室质量控制体系中重要部分，是保证患者检验结果和其报告的准确性和可靠性，以及各实验室间结果的可比性的重要手段。

2．适用范围：卫生部或省临检中心下发的PCR室间质控血清检测。

3．负责人：     操作人：

4．程序：

4.1质控标本的接收和验收：收到质控血清后由相关人员登记、签字，根据质控标本的有关说明对血清的数量、批号、包装进行验收并将质控标本按要求置-20℃保存于标本制备区。

4.2 质控标本的检测按常规临床标本对待，若需要，检测前先根据说明对质控物进行复溶。

4.3室间质评样本必须按实验室常规工作进行，由进行常规工作的人员测试，工作人员必须使用实验室的常规检测方法和试剂，不得特殊对待。检测结果须在截止日期前上报。

4.4实验室检测EQA样本的次数必须与常规检测病人样本的次数一样（即1次）。

4.5   EQA样本的检测在部或省临检中心规定的时间内进行，检测结果的上报也必须在截止  日期前，通过E-mail或挂号信寄出。

4.6室间质评的检测结果和反馈结果均记录于室间质评记录表，根据反馈结果分析室间质评的状态，如有出控应查找原因，并采取相应的措施。

4.7 严禁与其它实验室交流室间质评的检测结果。

5. 本文涉及以下图表：

室间质评记录表      

温度校准标准操作程序

1、目的： 保证实验时温度的准确

2、范围： 基因扩增实验室所有温控的仪器

3．负责人：       操作人：

4、程序

4.1温度计校准程序：

4.1.1 由设备科人员送质检局对温度计进行校准。每年进行1次。

4.1.2经校准过的温度计可作为微量恒温器温度校温的参照。

4.2 水浴箱温度校准程序：

4.2.1 将水浴箱调至所设置的温度，等水温稳定以后，进行测量。

4.2.2 取出一只已经技术监督局校准后的温度计进行测量。

4.2.3 计下读数，重复在不同温度下测量。

4.2.4 经测量的温度和水浴箱显示温度进行比较，计算出误差。

4.2.5 将水浴箱调至校准后的温度。

4.2.6 每次试验前都必须进行此项工作。

4.3  冰箱温度的校准：（4℃冰箱和—20℃冰箱）

4.3.1 每次实验前都需对冰箱温度进行记录，绘置冰箱温度的质控图。

4.3.2 取一只已经技术监督局校准后的温度计对冰箱温度进行实际测量，并计下读数。

4.3.3 反复多次测量，如超出规定范围，将冰箱调至所需温度。

4.4 扩增仪温度的校准

4.4.1 将扩增仪打开并设至一温度。

4.4.2 在扩增仪的温控孔入放一个反应管，待温度长至所设温度时，用一只已经持术监督局校准过和温度计插入反应管中进行测量温度并记录。

4.4.3 在不同温度点进行重复测量，取均值，并与扩增仪的显示温度进行比较。

4.4.4 由于仪器较精密，温度相差太大则需请厂家前来校准并调试。

4.4.5 经调试后贴上绿色标签，标明时间仪器的性能状态。

5.      本文涉及以下图表

PCR实验室环境温湿度记录表         

冰箱温度质控图                     

PE 5700型核酸扩增荧光仪操作维护程序

1．目的：使PE 5700型核酸扩增荧光检测仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。

2．适用范围：PE 5700型核酸扩增荧光检测仪。

3．负责人：        操作人：

4.  性能参数:见说明书。

5. 操作程序：

5．1 扩增反应前须先在PE5700 SDS 软件的设置面板上按照事先排好的标本位置进行设置。每次实验除了待检标本，还要包括一个阴性对照、一个阳性对照、一个阳性室内质控品、一组阳性标准品（4个梯度10⁴、10⁵、10⁶、10⁸）。

5．2 依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows NT界面。

5．3 接着打开光源检测器和PCR仪电源开关，预热5分钟。 

5．4 点击PE 5700 SDS 图标，打开软件。

5．5 在New plate Application 窗口分别选定5700/SYBR Green， 然后单击OK，打开一空白设置面板。

5．6 在Setup 版面设定样品种类与名称，数量。

5．6．1 在Type栏中选择类别：STND－标准梯度，UNKN－未知样品，

                             NTC－阴性对照，Not in use－未使用

5．6．2 再在Name栏中依次输入样品名称。

5．6．3 在框定所选标准梯度孔数后，需在工具栏中单击P窗口，选定PR1 primer SYBR后，关闭窗口，可见所选孔左下角有一长方形阴影。

5．6．4 在框定所选孔数后，在工具栏中单击Q窗口，即可在此窗口输入定值标准品的标准量。

5．7 点击Instrument 即可在此窗口设定循环参数。

5．8 选定任务栏File中的Save项，弹出对话框。在对话框中的File Name项下输入一组数字和（或）字母组成的文件名，选Save。

5．9 检查设置正确与否，运行程序

5．9．1 在设置完程序文件的Instrument窗口，点RUN键，即可运行。

5．9．2 反应结束后，选任务栏File中的Save项，保存实验结果。

5．10 关闭PE 5700 序列检测器开关，再关扩增仪开关。

5．11 结果分析标准程序：

对于5700结果曲线的分析，应按以下步骤进行：全部曲线——阴性对照——阳性对照——阳性室内质控品——阳性标准品——逐个分析（标出阳性标本和可疑标本）——调整参数，获得较好的标准曲线，显示定量结果——登记，发报告。

5．11．1 整体曲线的观察,将所有曲线选中进行整体观察.

a)观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），特别应注意大量曲线在同一Ct值出现上涨的情况。

b)观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。

5．11．2 阴性对照的分析

阴性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阴性标本。

作用：用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染。

5．11．3 阳性对照的分析

阳性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阳性标本。

作用：用以监测实验能否正常检出阳性标本，避免假阴性的出现。

5．11．4 阳性室内质控品的分析

阳性室内质控品：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知或未知浓度的阳性室内质控血清。

作用：用以监控日常实验的精密度。

5．11．5 阳性标准品的分析

a)各梯度曲线的分布是否均匀，若各梯度曲线均未分开，则表明阳性标准品稀释可能存在问题，提示实验中存在较大人为误差。

b)观察各曲线的Ct值是否在平日的正常位置：

情况1：若出现低拷贝标准品做不出，而各曲线Ct 值均后移，则判断是否为试剂扩增效率下降（如试剂过期或保存条件不合格）。

情况2：出现低拷贝标准品做不出，而高拷贝曲线Ct值均正常，则提示可能存在低拷贝阳性标准品的降解情况。

c) 每日必做10²标准品，用作以下三方面监控：

一 是否存在操作误差，如加样量过少等原因导致10²标准品未能检出；

二 是否存在稀释后的梯度放置过久，低拷贝标准品降解的情况；

三 若高拷贝标准品出现Ct值后移，且能排除情况A、B，则判断是否为试剂灵敏度下降。

5．11．6 单个曲线的判断

逐个分析每条曲线，判断曲线的阴阳性或属可疑曲线。（可疑标本是指曲线在27个Ct值后出现上涨且平台趋势不明显或上涨幅度比较低的标本。可疑标本要第二天重做，两次结果一致则报阳性，否则结果报阴性。）曲线观察内容：在基线选择2～8时观察△Rn值大小（是否有三期特征）。在基线选择0～0时观察Rn值曲线形状。

5．11．7 得出定量结果

调节基线和阈值以得到一较好的标准曲线。电脑据此曲线给出阳性结果值。此时应排除某些阴性标本因荧光曲线假性上扬而得出的假阳性结果和某些弱阳性标本因终末荧光值过低而显示的假阴性。

5．11．8发放报告

及时登记检测结果记录，发放临床报告。

5.12.维护和校准程序：

5.12．1 微软Windows NT工作站的维护

硬盘驱动器每月29日左右运行一次碎片清除程序，使用Norton Utilities或类似软件。具体步骤：

a）放入Norton Utilities光盘。

b）从My Computer打开Norton Utilities软件光盘。

c）启动清理碎片/优化程序。

d）运行完成后，检查以确信无严重错误记录，退出Norton Utilities。

e）取出Norton Utilities光盘，重新启动计算机。

5.12．2  PCR仪的维护

5.12．2．1 样品槽的清洁

样品槽每月进行一次清洁，如出现样品槽污染情况则随时清洁。

操作方法：

a）运行25℃HOLD程序使样品槽温度达到室温。关闭仪器，等待10分钟。

b）从样品槽移去样品架。

c）在样品槽中加入少量浓度≥95%乙醇，用尼龙棉签或塑料杆擦洗反应孔。

d）用干棉签吸干乙醇。

e）在PE 5700光源检测器未盖住样品槽时，打开PCR仪，并升温到50℃运行10分钟，以蒸发掉多余的乙醇。

5.12．2．2  热盖的清洁

热盖每月进行一次清洁，如有需要随时进行。

a）运行25℃HOLD程序使样品槽温度达到室温。关闭仪器，等待10分钟。

b）逆时针旋转PE 5700光源检测器顶部旋钮。向后推PE 5700光源检测器至滑轨距离的大约1/3处。

c）PE 5700光源检测器滑轨上有缺口。从这些缺口垂直抬起PE 5700光源检测器，小心侧放于仪器顶盖上。不要从仪器取走热盖。

d）用经过浓度≥95%乙醇湿润的镜头纸或脱脂棉球清洁加热盖，待干。

e）将PE 5700光源检测器重新安装回滑轨。

5.12．2．3  PE 5700光路系统的维护

5.12．2．3．1  调准ROI参照条

调准ROI参照条在仪器更换卤素灯、仪器定期校准或仪器维修后进行。不得由一般实验人员进行该项操作。

a）PCR仪样品槽中放入荧光检测板。

b）将PE 5700光源检测器向前拖动盖住样品槽，并旋紧。

c）从Start菜单选择运行PE 5700 SDS管理软件。

d）积分时间从512ms开始，用位置调整点，调节ROI的高度与右边线。

e）逐渐增加积分时间，直到可以看到至少四个块（约4096ms）。

f）调整最左侧位置调整点。

g）减少积分时间到1024ms，调整上方与底部的位置调整点。

h）减少积分时间以便最右侧块可见但未饱和（约512ms），调节最右侧位置调整点。如有需要用右上角拖动点调整图像的倾斜度（以左上角为中心旋转）。

i）调节后的参照条宽度必须在ROI参照块间有小空隙。

5.12．2．3．2  校正ROI光路

ROI光路校正每月进行一次，以便确信结果仍然是优化的。

a）在PCR仪样品槽中放入荧光检测板。

b）将PE 5700光源检测器向前拖动盖住样品槽，并旋紧。

c）从Start菜单选择运行PE 5700 SDS管理软件。

d）点选Show ROI复选框。每个样品孔周围出现一蓝色椭圆圈。

e）点选Show Saturation复选框。

f）设定积分时间为1024ms；打开卤素灯和光闸。

g）点击LIVE按钮获取图像，然后在任何地方左击停止。获取中等程度未饱和图像（无红色图像）。

h）从Edit菜单中选择Calibrate ROIs每个孔都会选取合适的ROI，确定96孔都被蓝色椭圆圈正确界定。

i）图像太亮太暗都会出现错误信息，相应增加或减少积分时间，并重复上述第8步直到无错误信息出现。

j）检查孔ROI位置，所有孔信息都应包含在96个ROI椭圆圈中。如果没有，重复8和9步。

5.12．2．3．3  检查PCR仪样品槽的荧光污染

检查PCR仪样品槽的荧光污染每月进行一次，如有需要随时进行。

a）开启PE 5700型核酸扩增荧光检测仪电源。

b）从Start菜单选择运行PE 5700 SDS管理软件。

c）从样品槽中移去反应板。

d）将PE 5700光源检测器向前拖动盖住样品槽，并旋紧。

e）设定积分时间为256ms；打开卤素灯和光闸。

f）点击LIVE按钮获取图像，然后在任何地方点击停止。

g）观察96孔中背景荧光。如孔有显著荧光则表示该孔存在荧光污染。

h）按照样品槽的清洁程序清洗样品槽。

5.12．2．3．4  更换卤素灯

仪器使用大约2000小时后应更换卤素灯,但具体要视卤素灯实际情况而定。

a）关闭PE 5700型核酸扩增荧光检测仪，冷却15分钟。

b）移去PE 5700光源检测器顶盖。

c）移去卤素灯顶盖。

d）把旧灯泡从插座中滑出，更换新卤素灯。确信灯正确安装在位置上。滑动灯泡时要轻轻抬起灯以避开装配螺丝钉。

e）重新装上灯顶盖和PE 5700光源检测器顶盖。

f）开启PE 5700型核酸扩增荧光检测仪电源，运行PE 5700 SDS管理软件。

g）通过软件控制卤素灯开关，确认灯随开关开闭。

h）开启光闸，确认光闸可打开。

i）设定积分时间为1024ms，点击LIVE。保证可以采集一幅数据图像。

j）若新卤素灯不工作，PE 5700电源保险管可能有问题。

5.12．3 校准

PE 5700型核酸扩增荧光检测仪为复杂精密仪器，其校准工作需由专业工程师进行。实验室应与仪器厂家达成协议，定期（一般每年一次）校准仪器。

平时通过对室内质控图的分析，发现实验结果出现系统误差后，又经过分析排除了试剂和人员误差，应怀疑是否仪器出现了检测偏差从而需要校准。

实验室人员根据上述“光路系统的维护”部分的内容调节光路，可初步确定仪器是否光路原因引起的检测偏差，通过光路调节解决问题。若问题不出在光路系统，则应联系仪器厂家派技术人员来进行校准。

注意事项：

a）仪器应放置在水平坚固的平台上，外界电源系统电压要匹配，并要求有良好的接地线。

b）环境温度保持在23℃左右，湿度保持在60％左右。

c）仪器应每月底清洁维护。

d）仪器使用时应严格遵守上述使用步骤。

6. 期间核查

(1)PE-5700基因扩增仪的定标不需要特别的周期间隔，本实验室PE-5700基因扩增仪执行卫生部临床检验中心的指定校准。

(2) 校准物均为与ICSH之标准相符合的校准物，测定值偏差均不超过其规定值。

7 . 相关记录

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仪 器 设 备 总 表

干式恒温器操作维护规程

1．目的：正确使用、维护和校准干式恒温器。

2．适用范围：干式恒温器。

3．负责人：       操作人：

4. 技术参数:见说明书。

5．程序：

5．1干式恒温器应置于坚固的水平台上，电源电压须匹配。

5．2 打开电源开关，设定温度时间至所需温度。

5．3 设定恒温时间至所需时间。

5．4 当测定温度达到设定温度时，加热中断、指示灯熄灭，测定温度小于设定温度时，指示灯亮，开始加热，如此反复，温度可保持稳定。

5．5 每年校正温度一次。

5．6 干式恒温器波动范围应控制在：温度 +/–1℃以内。

5．7温度误差校准

5．7．1本仪器出厂前温度己校准。但由于某些原因造成实际温度与显示温度之间存在偏差，可按以下方法修正温度误差；

注意！为了保证温度的准确性，本仪器采用两点温度校准法，即40℃与100℃两点温度同步线性校准法。经两点温度线性校准后，系统保证其它温度点的温度准确度≤±0.5℃。校准温度时环境温度和模块的温度必须低于30℃。

5．7．2具体操作方法如下：

a)仪器开机后，进入等待界面，此时观察温度显示窗温度，确认其温度值应小于35℃。若温度高于35℃，等温度降至35℃后，按以下方法操作。

b)将石腊油注入模块中心位置的一个锥形孔内，并于锥形孔中放入温度计（要求温度计精度为0.1℃，温度计感温包必须完全浸入于锥形孔内），模块上部用隔热材料于环境隔离。见下图a.

c)  同时按下▲和  键，进入温度校准界面，

此时，时间显示窗显示为：“ADLF”表示己进入温度校准程序；温度显示窗显示为即时温度，并自动开始升温至40.0℃

当温度升温至40.0℃恒温后,小数位开始闪烁,等待40℃的温度校准值。要求理温20分钟后，读取温度计的实测温度。

注意！为保证温度校准精度，建议用户于恒温20分钟后读取实测温度！

 若温度计读取的数值为39.6℃,则按“TEMP”和▲或  键于温度显示窗内输入39.6，按“R/S”键确认输入值。

d)接着仪器自动升温至100℃，于100℃恒温后等待输入温度校准值。同样要求恒温20分钟后，读取温度计的实测温度。

注意！为保证温度校准精度，建议用户于恒温20分钟后读取实测温度！

若温度计读取的数值为101.5℃，则按“TEMP”和▲或  键于温度显示窗内输入101.5，按“R/S”键确认输入值。

e)这样两点校温己完成，同时按下▲和  键，退出温度校准界面，返回至等待界面。

注意！两点温度校准过程中，同时按下▲和  键，则退出校温程序，己修正的温度值无效！

5．8 干式恒温器内外应保持清洁，外壳忌用腐蚀性溶液擦拭。

5．9 仪器长期不用时，需防潮防尘保存。

6. 仪器维护

(1) 本仪器应定期用干净软布沾少量无水酒精清冼模块上的锥孔,以保证试管与锥孔壁接触充分,导热良好,避免污染。

(2) 本仪器表面如有污染,可用软布沾清洁膏清冼。

(3) 该仪器在日常使用中请注意符合“5.”要求。

(4) 严格按照仪器的开关机程序关机。

6. 期间核查

(1) 干式恒温器的定标不需要特别的周期间隔。

(2) 每年必须校正温度一次。

7 相关记录：

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仪 器 设 备 总 表

离心机操作维护程序

1．目的：保证离心机的正常使用。

2．适用范围：适用于本室使用的普通离心机。

3．负责人：     操作人：

4. 性能参数:见说明书。

5．程序：

5．1 离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使仪器处于水平位置以免离心时造成仪器振荡。

5．2 打开电源开关，将预先平衡好的样品对称放置于转头的样品架上，关闭机盖。

5．3 旋动定时旋钮设定离心时间，缓慢旋转转速调节旋钮使仪器转速达到预定要求。

5．4 离心完毕后，将转速调节旋钮调回零位，关闭电源开关。

5．5 待离心机完全停止转动时打开机盖，取出离心样品，再次关闭机盖结束离心。

5．6 离心室的清洁：为了避免样本等残留物的污染，应经常对离心机外壳和离心室进行清洁处理。对离心室清洁，应先打开离心机盖，拨掉电源线，用专用设备将离心机转子旋下，再用中性去污剂（70%的异丙醇/水混合物或乙醇去污染）清洁离心室；离心室内的橡胶密封圈经去污剂处理后，用水冲洗，再用甘油润滑。

5．7 转子的清洁：转子会被样本残留物污染，也可能会被某些化学试剂腐蚀，因此应对转子每月进行清洁维护。每月用中性的清洁剂清洁转子一次，并在仪器维护记录本上作好记录，以延长转子的寿命。

6. 仪器维护

(1) 为确保安全和离心效果,仪器必须放置在坚固水平的台面上,塑料盖门上不得放置任何物品,样品必须对称放置,并在开机前确保已拧紧螺母。

(2) 应经常检查转头及试验用的离心管是否有裂纹,老化等现象,如有须及时更换.

(3) 试验完毕后,需将仪器擦拭干净,以防腐蚀.

(4) 如样品比重超过1.2g/cm³,最高转速n按下式计算:n=nmax*√--1.2/样吕比重.

(5) 当电机碳刷长度小于6mm时,必须及时更换.

(6) 在离心机未停稳时不得开盖.

(7) 仪器必须有可靠接地.

(8) 实验结束后,请关闭后面的电源开关,拨掉电源插头时,请不要忘了打开后面的电源开关.

(9) 该仪器在日常使用中请注意符合“5.6,5.7”要求。

      (10) 严格按照仪器的开关机程序关机。

7. 期间核查

(1)本仪器不需要特别的周期间隔。

(2) 校准物均为与ICSH之标准相符合的校准物，测定值偏差均不超过其规定值。

8. 相关记录

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仪器设备总表

冰箱操作维护规程

1．目的：对冰箱进行适当的维护，以确保冰箱的正常使用。

2．适用范围：本实验室使用的各种品牌、型号的冰箱。

3．负责人：      操作人：

4.  性能参数:见说明书。

5．程序：

4．1  开、关机：冰箱按说明书要求放好后，插上电源线，冷藏室温度开关置于4℃，冷冻室温度开关置于 -20℃，2小时后用温度计确认。系统进入正常运行状态后即可使用。

4．2 外冰箱应放置于水平地面并留有一定的散热空间。外接电源电压必须匹配，并要求有良好的接地线。

4．3 冰箱内禁止存放与本实验室无关的物品。

4．4 放入冰箱内的所有试剂、样品、质控品等必须密封保存。

4．5 保持冰箱出水口通畅；非自动除霜冰箱应在每月底除霜；月底清洁冰箱，清洁时切断电源，用软布蘸水擦拭冰箱内外，必要时可用中性洗涤剂。

4．6 每日观察冰箱内温度并记录于冰箱的质控图上。

4．7 若温度超出规定范围，调节温控使其回到正常范围，并进行记录。    

4．8 若温控调节无效，报请设备科维修，修理后须验收合格并签字后方能正常使用。

6. 仪器维护

(1) 使用注意。该仪器在日常使用中请注意符合“4. 注意事项”要求

(2) 废液瓶满要及时倒掉废液，切勿强行扯动红黄两根管来打开瓶盖，检查废液瓶是否漏气，防止低真空出现。

(3) 当出现堵孔时，按自动冲洗键冲洗管道。

 (4) 严格按照仪器的关机程序关机。

7. 期间核查

(1冰箱不需要特别的周期间隔。

(2) 校准物均为与ICSH之标准相符合的校准物，测定值偏差均不超过其规定值。

8 . 相关记录

仪器使用登记表

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仪 器 设 备 总 表

生物安全柜操作维护规程

1．目的：正确使用生物安全柜。

2．适用范围：本SOP适用于本实验室使用的生物安全柜。

3．负责人：      操作人：

4.  性能参数:见说明书。

5．程序：

5．1 新安装或长期未使用的生物安全柜，使用前必须用超净真空吸尘器或不产生纤维的物品认真进行清洁工作。5．2 接通电源，使用前应提前15～30分钟同时开启紫外灯和风机组工作。

5．3 当需要调节风机风速时，用生物安全柜操作面板上的风速调节钮进行调节。风机、照明均由指示灯指示其工作状态。

5．4 工作台面上禁止存放不必要的物品，以保持工作区的洁净气流不受干扰。

5．5 禁止在工作台面上记录书写，工作时应尽量避免作明显扰动气流的动作；禁止在预过滤进风口部位放置物品，以免挡住进风口造成进风量减少，降低净化能力。

5．6 使用结束后，用消毒液清理工作台面后打开紫外灯，15～30分钟后关闭紫外灯，关闭生物安全柜电源。每次使用生物安全柜后，均需对其进行清洁。

5．7根据环境洁净程度，定期将预过滤器中的滤料拆下清洗，一般间隔时间为3～6个月。

5．8定期（一般每半年1次）计测工作区风速，如发现不符合技术参数要求，则可调大风机供电电压。当风机组电压调到最大时，工作区风速仍达不到0.3m/s，则必须更换高效空气过滤器（由厂家或院仪器维修人员进行）。4．9有相应的维护记录，长期不使用的生物安全柜拨下电源插头。

6. 仪器维护

(1) 使用注意。该仪器在日常使用中请注意符合“4. 注意事项”要求

(2) 废液瓶满要及时倒掉废液，切勿强行扯动红黄两根管来打开瓶盖，检查废液瓶是否漏气，防止低真空出现。

(3) 当出现堵孔时，按自动冲洗键冲洗管道。

 (4) 严格按照仪器的关机程序关机。

7. 期间核查

(1)PE-5700基因扩增仪的定标不需要特别的周期间隔，本实验室PE-5700基因扩增仪执行卫生部临床检验中心的指定校准。

(2) 校准物均为与ICSH之标准相符合的校准物，测定值偏差均不超过其规定值。

8. 相关记录

仪器使用登记表

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仪器报废（停用）单

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仪 器 设 备 总 表

移液器操作维护规程

1．目的：确保移液的精确性，正确使用移液器。

2．适用范围：本实验室使用的可调式移液器。

3．负责人：        操作人：

4．程序：

4．1移液器的使用

4．1．1转动旋钮设定移液量，设定的移液量不可超出该移液器规定的范围。

4．1．2 装上配套的Tip。

4．1．3 前进移液法

a） 将按钮压至第一停点位置；

b ）将移液管管嘴浸入液面下2~3mm深处，然后慢慢松开按钮吸入液体。待移入管嘴吸满液体后，将管嘴撤出液面，擦掉管嘴外侧的所有液滴。

c） 轻轻压下操作按钮至第一停点位置，放出液体。约1秒钟后，继续将操作按钮向下压至第二停点位置。待管嘴液体放干净后，将管嘴贴在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中，撤出管嘴。

d）松开按钮使之回到起点位置。需要时，可更换管嘴继续移液操作。

4．1．4 倒退移液法：适用于高粘度液体及/或易起泡沫液体的移液。

a） 将操作按钮向下压至第二停点位置。

b）将移液管管嘴浸入试剂瓶液面下2~3mm深处，然后慢慢松开钮吸入液体。待移入管嘴吸满液体后，将管嘴撤出液面，擦掉管嘴外侧的所有液滴。

c ）轻轻压下操作按钮至第一停点位置，放出液体。

d）遗留在管嘴时的液体或者随管嘴一起扔掉，或者放回原来的容器中。

4．1．5 重复操作法：重复操作移液法可以快速、简便地重复转移同体积的同种液体。

a）将操作按钮向下压至第二停点位置。

b）将移液管管嘴浸入液面下2~3mm深处，然后慢慢松开按钮吸入液体。待移入管嘴吸满液体后，将管嘴贴在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中。

c）轻轻压下操作按钮至第一停点位置，放出液体。待放完所需体积液体后，把按钮停在第一停点位置，不包括在移液量之内的少量液体仍留在管嘴内，管嘴外的液滴则需包括在移液量之内。

d ）将管嘴浸入试剂液面下不远处，然后慢慢松开按钮使管嘴重新吸入液体。

e）重复步序c）和d ）继续移液操作，就可重复转移相同体积液体。

4．2  移液器的维护

每天对使用过的移液器用75%酒精进行擦拭。每周1次对移液器咀进行75%酒精浸泡15分钟左右，若使用过程中发生污染应随时浸泡处理。

4．3移液器的校准

为确保移液器加样的精确性和准确性，正确使用移液器，需定期（一年）对移液器进行校准

4．3．1 校准环境和用具要求

室温：20～25℃，测定中波动范围不大于±0.5℃。

电子天平：放置于无尘和震动影响的台面上，房间尽可能有空调。称量时，为保证天平内的湿度（相对湿度60～90%），天平内应放置一装有10mL蒸馏水的小烧杯。

小烧杯：5～10mL体积。

测定液体：温度为20～25℃的去气双蒸水。

选定校准体积：

a）拟校准体积；

b）移液器标定体积的中间体积。

c）最小可调体积（不小于拟定体积的10%）。

如为固定体积移液器，则只有一种校准体积。

4．3．2 校准步骤

a）将移液器调至拟校准体积，选择合适的吸头；

b）调节好天平；

c）来回吸吹蒸馏水3次，以使吸头湿润，用纱布拭干吸头；

d）垂直握住移液器，将吸头浸入液面2～3mm，缓慢（1～3秒）一致地吸取蒸馏水

e）将吸头离开液面，靠在管壁，去掉吸头外部的液体；

f）将移液器以30℃角放入称量烧杯中，缓慢一致地将移液器压至第一档，等待1～3秒，再压至第二档，使吸头里的液体完全排出；

g）记录称量值；

h）擦干吸头外面；

i）按上步骤称量10次；

j）取10次测量值的均值作为最后移液器吸取的蒸馏水重量，按表1所列蒸馏水Z因子计算体积；

k）按校准结果调节移液器。

4．3．3 比较校准法

利用经计量局校准并颁发校准报告之同型号移液器，在移液器量程范围的高低两个档各选择一个校准点，利用电子天平称量结果与已校准移液器称量结果进行比较，完成校准。

备注：连续可调移液器校准由本市标准计量局统一校准。

（表1  蒸馏水Z因子 hPa(mbar)）

5. 相关记录

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沙眼衣原体核酸扩增荧光检测

1．  目的：保证CT DNA检测结果准确、可靠。

2．  适用范围：CT DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为分泌物。

3．  负责人：     操作人：

4．  原理：本试剂盒用一对沙眼衣原体特异引物和一条沙眼衣原体特异性荧光探针，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，再用PCR体外扩增法检测沙眼衣原体DNA。

5．  性能参数：检出低值＜25基因拷贝/ml。

6． 标本要求：

（1）标本类型：分泌物。

（2）标本采集：见标本采集手册。

（3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，4-8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。室温运输。

（4）标本拒收状态：细菌污染标本不能作测定。

7． 容器和添加剂类型：无菌离心管和无菌试管。

8．  所需设备：ABI GeneAmp 5700、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯

9．  试剂：DNA提取液（500μl/管）2管；CT-PCR反应液（未贴标签管）20管；阳性定量质控标准品（1×10⁸基因拷贝/ml）（50μl/管）1管；阴性质控品（250μl/管）1管。

10．   校准程序（计量学溯源性）：送XXX市计量检测所校准。

11．   程序步骤:：

11.1标本采集、保存和运送

男性：取尿道分泌物或细小棉拭子伸入快尿道约2~4cm，略捻拭子取出分泌物（应略带黏膜）。将分泌物或棉拭子置入无菌玻璃管，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。

女性：阴道—用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒钟后旋动棉拭采取宫颈分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。

尿道—用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2cm，略捻拭子取出分泌物（应略带黏膜）。将棉拭子置入无菌玻璃管，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。

标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送应采用0℃冰壶。

11.2标本及对照标准品的处理

标本试管中加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，吸取液体转至1.5ml离心管中（如分泌物较多，只取0.2ml）12000rpm离心5分钟.沉淀加无菌生理盐水1ml打匀,12000rpm离心5分钟,再重复洗涤一次.沉淀直接加50ulDNA提取液充分混匀, (提取液内含不溶于水的物质,取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。) 沸水浴10分钟（误差不超过1分钟），转至4℃静置6-8小时以保证充分裂解。12，000rpm离心2分钟，取上清液2ul做PCR反应。另取阴阳性质控标准品各50ul加等量DNA提取液打匀，沸水浴10分钟后同上处理。

11.3GeneAmp5700操作

取单管单人份PCR反应管若干管，直接加入处理后样品（或阴阳性质控标准品）2ul，6000rpm离心数秒。将各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：

ABI GeneAmp5700的循环条件：93℃  2分钟预变性，然后按93℃45秒  55℃60秒，先做10个循环，最后93℃30秒  55℃45秒，做30个循环。所有设置全部完成后保存文件，最后运行程序。

11.4结果分析条件的设定

ABI GeneAmp5700的条件设置：反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值(2~4),stop值(7~9)以及Threshold值,使阴性质控品Ct值为30,临界阳性质控标准品Ct值为22~24, 强阳性质控标准品Ct值为18~20,最后记录仪器自动分析计算出的Ct值.

12．   质量控制程序：

阴性质控品：全部阴性

阳性定量标准品：全部阳性

︱r︱≧0.97(correlation 数值介于-0.97~-1); 10⁸至10⁴基因拷贝/ml的阳性标准品检测的定量值与理论值相比误差小于±300%。

13．   干扰：标本污染。

14．    生物参考区间：正常人样本为阴性或0基因拷贝/ml。

15．    患者检验结果的可报告区间：Ct值<40，实验样本的CT DNA含量（基因拷贝数/ml）=M；Ct值=40，样品 CT DNA含量<25基因拷贝/ml。

16．   警告/危急值（当适用时）：

17．   实验室解释：为沙眼衣原体感染的辅助诊断以及治疗提供分子生物学上的参考依据。

18．   其它：《沙眼衣原体核酸扩增荧光检测试剂盒说明书》见试剂盒

乙肝病毒核酸扩增荧光检测

1． 目的：保证HBV DNA检测结果准确、可靠。

2． 适用范围：HBV DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为血清。

3． 负责人：        操作人：

4． 原理：本试剂盒用一对乙型肝炎病毒特异引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，再用PCR体外扩增法检测丙型肝炎病毒cDNA。

5． 性能参数：检出低值＜1×10³基因拷贝/ml。

6． 标本要求：

（1）标本类型：血清。

（2）标本采集：见标本采集手册。

（3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，4-8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。室温运输。

（4）标本拒收状态：细菌污染、严重溶血或脂血标本不能作测定。

7． 容器和添加剂类型：无菌离心管和无菌真空管

8． 所需设备：ABI GeneAmp 5700、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯

9． 试剂：DNA提取液（500μl/管）2管；HBV-PCR反应液（未贴标签管）20管；阳性定量质控标准品（1×10⁸基因拷贝/ml）（50μl/管）1管；阴性质控品（250μl/管）1管。

10．             校准程序（计量学溯源性）：送深圳市计量检测所校准。

11．             程序步骤:：

11.1标本处理：取血清标本40μl，加等量DNA提取液打匀。（提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。）沸水浴10分钟（误差不超过1分钟），（为保证病毒颗粒充分裂解可转至4℃静置8~12小时）。10000rpm离心5分钟，取上清2μl做PCR反应。

11.2标准品稀释和处理：将阳性定量质控标准品（1×10⁸基因拷贝/ml）6000rpm离心数秒标示为10⁸，另取4支灭菌新0.5ml离心管，分别加入45μl阴性质控品，依次标示为10^7~10⁴。吸取10⁸管5μl至10⁷管，用加样器反复混匀后换新吸头取5μl至10⁶管，依次方法稀释至10⁴管。-20℃保存；分别吸取稀释好的阳性标准品梯度和阴性质控品管各40μl，加等量DNA提取液打匀，以下步骤同上处理。

11.3PCR扩增：取HBV-PCR反应管若干管，直接加入处理后的样品管或阴阳性质控标准品2μl，6000rpm离心1分钟。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品，阳性定量质控标准品梯度以及未知标本，并设置样品名称，标记荧光基团种类和循环条件：ABI GeneAmp 5700的循环条件：93℃→2分钟预变性，然后按93℃45秒→55℃60秒，先做10个循环，最后按93℃30秒→55℃45秒，做30个循环。所有设置全部完成后保存文件，最后运行程序。

11.4结果分析条件的设定：ABI GeneAmp 5700的条件设置：反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图象调节baseline的start值（2~4），stop值（7~9）以及Threshold值，使Std curve窗口下的标准曲线达到最佳（correlation数值介于-0.97~-1之间，correlation数值等同于|r|），最后到Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（Qty）。

12．             质量控制程序：

阴性质控品：全部阴性

阳性定量标准品：全部阳性

︱r︱≧0.97(correlation 数值介于-0.97~-1); 10⁸至10⁴基因拷贝/ml的阳性标准品检测的定量值与理论值相比误差小于±300%。

13．             干扰（如乳糜血、溶血、胆红素血）和交叉反应：乳糜血、溶血、胆红素血基本不影响本实验的测定。

14．             生物参考区间：正常人样本为阴性或0基因拷贝/ml。

15．             患者检验结果的可报告区间：Ct值<40，实验样本的HBV DNA含量（基因拷贝数/ml）=M；Ct值=40，样品 HBV DNA含量<1 ×10³基因拷贝/ml。

16．             警告/危急值（当适用时）：

17．             实验室解释：为乙型肝炎感染的辅助诊断以及治疗提供分子生物学上的参考依据。

18．             其它：《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光检测试剂盒说明书》见试剂盒

丙肝病毒核酸扩增荧光检测

1． 目的：保证HCV DNA检测结果准确、可靠。

2． 适用范围：HCV DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为血清。

3． 负责人：        操作人：

4． 原理：本试剂盒用一对丙型肝炎病毒特异引物和一条丙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以逆转录液，逆转录酶，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，先将RNA逆转录成cDNA，再用PCR体外扩增法检测丙型肝炎病毒cDNA。

5． 性能参数：检出低值＜1×10³基因拷贝/ml。

6． 标本要求：

（1）标本类型：血清。

（2）标本采集：见标本采集手册。

（3）标本储存和运输：室温放置不超过2小时，4-8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融，室温运输。

（4）标本拒收状态：细菌污染、严重溶血或脂血标本不能作测定。

7． 容器和添加剂类型：无菌离心管和无菌真空管。

8． 所需设备：ABI GeneAmp 5700、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯。

9． 试剂：DNA提取液（500μl/管）2管；HCV-PCR反应液（未贴标签管）20管；阳性定量质控标准品（1×10⁸基因拷贝/ml）（50μl/管）1管；阴性质控品（250μl/管）1管。

10．             校准程序（计量学溯源性）：

11．             程序步骤:：

11.1标本采集和运送

用无菌注射器抽取受检者静脉血1ml，注入无菌1.5ml离心管,于室温静置2小时,转至4℃静置1小时。8000rpm离心5分钟，吸取200ul血清(注意勿带入红细胞)转入另一无菌1.5ml离心管，即为血清标本。标本可立即用于测试（48小时以内），也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送应采用0℃冰壶。

11.2标本及对照标准品的处理

     向一新的经高压灭菌处理过的0.5ml离心管中加入10ul充分混匀的RNA提取液(RNA 提取液A易沉淀,取样前需用移液器反复吸打混匀后吸取)。加入50ul血清或阴阳性质控标准品，再加入200ul的RNA提取液B充分混匀。室温放置5分钟，6000rpm，离心1分钟，小心吸去上清，用75%的预冷乙醇（DEPC水配制）洗沉淀两次。（取75%乙醇400ul洗沉淀，充分震荡混匀，6000rpm，离心1分钟，然后去上清，再用75%的乙醇400ul重复同上处理），65℃干燥沉淀10分钟。（注：75%的乙醇配制时须用试剂盒中提供的DEPC H₂O）。

11.3逆转录

向沉淀管加入18ul HCV反应液I以及逆转录酶系2ul，震荡均匀，瞬间（3秒）离心后37℃放置45分钟，95℃加热3分钟。瞬间（3秒）离心后，吸取5ul逆转录产物做PCR反应。

11.4PCR扩增及DA-620仪器荧光检测操作

取单管单人份PCR反应管若干管，直接加入处理后样品（或阴阳性质控标准品）2ul，6000rpm离心数秒。将各后应管放入PCR仪器的孔反应槽内，在电脑上按对应顺序设置阴阳性质控标准品以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团类和循环条件：

ABI GeneAmp5700的循环条件：93℃  2   分钟预变性，然后按93℃45秒  55℃60秒，先做10个循环，最后93℃30秒  55℃45秒，做30个循环。所有设置全部完成后保存文件，最后运行程序。

11.5结果分析条件的设定

ABI GeneAmp5700的条件设置：反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值(2~4),stop值(7~9)以及Threshold值,使阴性质控品Ct值为30,临界阳性质控标准品Ct值为22~24, 强阳性质控标准品Ct值为18~20,最后记录仪器自动分析计算出的Ct值.

12. 质量控制程序：

13. 干扰（如乳糜血、溶血、胆红素血）和交叉反应：乳糜血、溶血、胆红素血基本不影响本实验的测定。

14. 生物参考区间：正常人样本为阴性或0基因拷贝/ml。

15. 患者检验结果的可报告区间：Ct值<40，实验样本的HCV DNA含量（基因拷贝数/ml）=M；Ct值=40，样品 HCV DNA含量<1 ×10³基因拷贝/ml。

16. 警告/危急值（当适用时）：

17. 实验室解释：为丙型肝炎感染的辅助诊断以及治疗提供分子生物学上的参考依据。

18. 其它：《丙型肝炎病毒核酸扩增荧光检测试剂盒说明书》见试剂盒

结核杆菌核酸扩增荧光检测

1． 目的：保证TB DNA检测结果准确、可靠。

2． 适用范围：TB DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为血清。

3． 负责人：      操作人：  

4． 原理：本试剂盒用一对结核杆菌特异引物和一条结核杆菌特异性荧光探针，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，再用PCR体外扩增法检测结核杆菌DNA。

5． 性能参数：检出低值＜1×10³基因拷贝/ml。

6． 标本要求：

（1）标本类型：血清。

（2）标本采集：见标本采集手册。

（3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，4-8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。室温运输。

（4）标本拒收状态：细菌污染、严重溶血或脂血标本不能作测定。

7． 容器和添加剂类型：无菌离心管和无菌真空管。

8． 所需设备：ABI GeneAmp 5700、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯

9． 试剂：DNA提取液（500μl/管）2管；TB-PCR反应液（未贴标签管）20管；阳性定量质控标准品（1×10⁸基因拷贝/ml）（50μl/管）1管；阴性质控品（250μl/管）1管。

10．             校准程序（计量学溯源性）：送深圳市计量检测所校准。

11．             程序步骤:：

11.1标本处理：标本采集、保存和运送     

用无菌5ml玻璃管取受检者肺深部咳出痰液1~3ml，密闭，即为标本。或直接抽取外周血2ml（抗凝）。标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为六个月。标本运送应采用0℃冰壶。

11.2标本及质控标准品的处理

痰液中加入4倍体积的4%NaOH室温放置10分钟后15000rpm离心5分钟。去上清，沉淀加无菌生理盐水1ml打匀，15000rpm离心5分钟；再重复洗涤一次。（知液标本直用淋巴细胞分离液分离沉淀）沉淀直接加50ulDNA提取液充分混匀,(提取液内含不溶于水的物质,取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。)沸水浴10分钟（误差不超过1分钟），转至4℃静置6-8小时以保证充分裂解。10，000rpm离心5分钟，取上清液2ul做PCR反应。另取阴阳性质控标准品各40ul加等量DNA提取液打匀，沸水浴10分钟后同上处理。

11.3PCR扩增及DA-620仪器荧光检测操作

取单管人份PCR反应管一管，直接加入处理后样品或阴阳性质控品2ul，6000rpm离心数秒。将各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：

93℃  2分钟预变性,然后按93℃45秒  55℃120秒,反应10个循环后置33℃保温,迅速逐个将反应管放入荧光检测仪,读取并记录读当数A₀。荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。最后按93℃45秒  55℃120秒，共做30个循环后置33℃保温。使用PE9600，9700，2400仪器循环参数为93℃30秒  55℃60秒，其它仪器循环参数为93℃45秒  55℃120秒。

PCR反应后荧光检测，待各PCR管充分冷却至33℃后，迅速逐个将扩增后的反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数A₁。荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。

11.4 ABI GeneAmp5700操作

将各后应管放入PCR仪器的孔反应槽内，按对应顺序设置阴阳性质控标准品以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团类和循环条件：

ABI GeneAmp5700的循环条件：93℃  2分钟预变性，然后按93℃45秒  55℃60秒，先做10个循环，最后93℃30秒  55℃45秒，做30个循环。

11.5结果分析条件的设定

ABI GeneAmp5700的条件设置：反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值(2~4),stop值(7~9)以及Threshold值,使阴性质控品Ct值为30,临界阳性质控标准品Ct值为22~24,强阳性质控标准品Ct值为18~20,最后记录仪器自动分析计算出的Ct值.

12．             质量控制程序：

阴性质控品：全部阴性

阳性定量标准品：全部阳性

︱r︱≧0.97(correlation 数值介于-0.97~-1); 10⁸至10⁴基因拷贝/ml的阳性标准品检测的定量值与理论值相比误差小于±300%。

13．             干扰（如乳糜血、溶血、胆红素血）和交叉反应：乳糜血、溶血、胆红素血基本不影响本实验的测定。

14．             生物参考区间：正常人样本为阴性或0基因拷贝/ml。

15．             患者检验结果的可报告区间：Ct值<40，实验样本的TB DNA含量（基因拷贝数/ml）=M；Ct值=40，样品 TB DNA含量<1 ×10³基因拷贝/ml。

16．             警告/危急值（当适用时）：

17．             实验室解释：为结核杆菌感染的辅助诊断以及治疗提供分子生物学上的参考依据。

18．             其它：《结核分支杆菌核酸扩增荧光检测试剂盒说明书》见试剂盒

高速冷冻离心机使用、维护标准操作程序

1．目的：保证高速冷冻离心机的正常使用。

2．适用范围：适用于本室使用的高速冷冻离心机。

3．负责人：       操作人：

4. 性能参数:见说明书。

5．程序：

5．1 离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使仪器处于水平位置以免离心时造成仪器振荡。

5．2 打开电源开关，将预先平衡好的样品对称放置于转头的样品架上，关闭机盖。

5．3 旋动定时旋钮设定离心时间，缓慢旋转转速调节旋钮使仪器转速达到预定要求。

5．4 离心完毕后，将转速调节旋钮调回零位，关闭电源开关。

5．5 待离心机完全停止转动时打开机盖，取出离心样品，再次关闭机盖结束离心。

5．6 离心室的清洁：为了避免样本等残留物的污染，应经常对离心机外壳和离心室进行清洁处理。对离心室清洁，应先打开离心机盖，拨掉电源线，用专用设备将离心机转子旋下，再用中性去污剂（70%的异丙醇/水混合物或乙醇去污染）清洁离心室；离心室内的橡胶密封圈经去污剂处理后，用水冲洗，再用甘油润滑。

5．7 转子的清洁：转子会被样本残留物污染，也可能会被某些化学试剂腐蚀，因此应对转子每月进行清洁维护。每月用中性的清洁剂清洁转子一次，并在仪器维护记录本上作好记录，以延长转子的寿命。

6. 仪器维护

(1) 为确保安全和离心效果,仪器必须放置在坚固水平的台面上,塑料盖门上不得放置任何物品,样品必须对称放置,并在开机前确保已拧紧螺母。

(2) 应经常检查转头及试验用的离心管是否有裂纹,老化等现象,如有须及时更换.

(3) 试验完毕后,需将仪器擦拭干净,以防腐蚀.

(4) 如样品比重超过1.2g/cm³,最高转速n按下式计算:n=nmax*√--1.2/样吕比重.

(5) 当电机碳刷长度小于6mm时,必须及时更换.

(6) 在离心机未停稳时不得开盖.

(7) 仪器必须有可靠接地.

(8) 实验结束后,请关闭后面的电源开关,拨掉电源插头时,请不要忘了打开后面的电源开关.

(9) 该仪器在日常使用中请注意符合“5.6,5.7”要求。

      (10) 严格按照仪器的开关机程序关机。

7. 期间核查

(1)本仪器不需要特别的周期间隔。

(2) 校准物均为与ICSH之标准相符合的校准物，测定值偏差均不超过其规定值。

8. 相关记录

仪器使用登记表

仪器设备维护和校准记录表

仪器设备检定周期表

仪器设备维修申请表

仪器报废（停用）单

仪器设备使用授权表

仪器设备档案卡

仪器设备领（借）用登记表

仪器设备总表

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