无菌检测风险控制

无菌检测的风险

假阳性：结果呈阳性，但污染不是产品所带来的，而是其他方面，比如测试环境、方法、人员、操作等方面所带来的污染。这种结果带来的后果往往是企业花费大量的人力、物力和财力去进行长时间的调查，调查后却找不到污染的根本原因，整批产品遭到报废，并且法规禁止不以发现造成污染的根本原因为目的而只是重复测试的行为。

假阴性：结果呈阴性，但产品本身是存在微生物污染的，是由于微生物受到抑制或伤害没有恢复出来才没有生长。这种情况下，厂家会释放产品，导致的后果有可能是，给药后，微生物在合适的环境下大量增殖，病人遭受严重的伤害甚至危害到患者的生命。而企业则会面临产品召回，品牌受损甚至工厂关闭风险。

无菌检测环境因素

关于环境因素，主要是防止在试验过程中的外来污染对于检测过程的影响，防止假阳性的出现。尤其是针对于直接接种法和开放式薄膜过滤法的无菌检测方法，外部环境的污染问题就成为无菌试验假阳性的最大可能。因此目前封闭式薄膜过滤法应用的越来越多。即便如此，外部环境的影响仍然对于样品检测是非常大的风险。目前对于环境控制的方法主要有两个：B级下的局部A级（万级下的局部百级——2010版中国药典）操作区域，或者隔离器中进行无菌操作。如果操作正确的话，两种方式均能够给我们的实验室实现“近似”无菌的操作环境。

洁净室中进行无菌检测

对于B级下的A级（国内通常是万级下的百级）操作区域，通常是由层流台来实现的，无论是垂直层流还是水平层流都能够满足我们的无菌检验需求。但是从工作原理上看，生物安全柜并不适合进行无菌试验。应该定期对于层流台进行检测，尘埃粒子、风速、沉降菌、浮游菌等关键技术指标以保证该系统处于正常的工作状态之中。对于万级设施，应该将其等同视为生产区洁净室进行控制，给局部百级一个较好的外部环绕环境，能够更好地保证局部百级的运行。

在实验过程中，无菌的保持也非常重要，特别是防止交叉污染，人员的操作和物品的位置移动都会造成这样的情况。这就对人员的要求非常高，特别是对于“无菌意识”的提高，通常是最容易讲但是也最难培训的技能和意识。整个检测过程中一定要注意几个原则：

1．物品可以从洁净的“高级别”到“低级别”转移，但是不可以从“低级别”到“高级别”转移。进入洁净室的人员必须经过无菌穿衣验证，只有有资质的人员才可以进入洁净室。

2．手作为交叉污染的媒介，应该及时定期对手套使用消毒剂进行清洁，如果有微生物污染风险较高的操作，应该及时对手套和无菌衣进行更换。

3．所有需要进入实验操作区域的物品必须在经过适当处理后才进行操作。

4．试验过程中一定要注意人的操作对于气流和待试验物品的污染。所有物品的去污染化，主要指的是物品的灭菌处理和转移方式。对于可以进行高温高压进行过度灭菌的物品，应尽量采取使用这种方式（如果有双门消毒锅可以直接从无菌室将灭菌完毕的产品取出，如果没有双门消毒锅，则需要将灭完菌的物品再次通过传递窗传入洁净室），如果该物品无法进行高温高压过度灭菌，则尽量通过浸泡的方式对表面的微生物进行去污染处理（如西林瓶装的样品和添加剂等），如果无法进行浸泡，则应该全面地进行消毒剂的喷洒和擦拭进行外表面的清洁。对于传入传递窗的物品的外包装，应尽量选用玻璃或者不锈钢这一类的材质，尽量减少选用软袋类的材质（软袋类材质带有大量的褶皱，很难对所有的外表面进行清洁）。

隔离器中进行无菌检测

对于隔离器，它能够提供一个相对较好的操作环境，由于相对封闭的腔体，加上所有的空气进出均通过高效过滤装置，所有物品进出必须经过相应的熏蒸。不同于层流台，它对于外部环境也没有那么高的要求，对于人员也不需要像洁净室那样严格的控制。但是它所达到的无菌环境的能力要更强于层流台。当然，在隔离器中进行无菌检测需要实验人员对无菌实验有更好的计划性，例如每次实验前需要有一个实验物品的清单，防止在实验过程中发现有物品的遗漏。而隔离器本身也需要有完整的灭菌记录，需要定期的维护保养和验证试验。

洁净室/隔离器环境监控

单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。

检测对象：人员，空气，设备

检测方法：浮游菌、沉降菌、表面微生物、尘埃粒子

无菌检测方法因素

当进行产品无菌检查法时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。对于无菌检测的方法设计应考虑到：过滤性；化学兼容性，膜的兼容性；冲洗液类型及体积；潜在抑制问题

无菌检查是根据是否有微生物在液体培养基中生长来进行判断的。培养14天后，观察培养基有否变浊。

无菌检测方法包括薄膜过滤法（开放式无菌检查法及封闭式无菌检查法）和直接接种法。

对于直接接种法，药典中有描述：取规定量供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%。实践中，有两种情况会选择直接接种法，一种情况是供试品不可过滤或经过处理后也很难过滤，从而不能应用薄膜过滤法，还有一种情况是该品种项中要求用直接接种法来进行无菌检查。除此之外都应选择薄膜过滤法。

直接接种法的主要优点是适用于不可过滤的样品；有些医疗器械的无菌检查用直接接种法会比较方便，只需将其浸没在培养基中即可。缺点是其属于开放式的操作，容器的灭菌处理，打开容器，样品打开包装，接种等方面样品、容器、培养基都与外界环境有直接接触。风险包括会有污染的风险，造成假阳性的结果；药品中或多或少都有一些抑菌的成分，如果用薄膜过滤法，那么通过滤膜的过滤作用加上后续的冲洗步骤，可以尽可能的把这些成分冲洗掉，这样截留在膜片上的微生物就能得到有效的恢复，而直接接种法做不到这一点；微生物得不到有效的恢复，造成假阴性的结果，样品直接放在装有培养基的试管或容器中，会对实验结果的观察造成一定的影响。因此，往往需要后续的再转接环节；观察不到长菌的情况，造成假阴性的结果。另外，从操作性上直接接种法也有很大的局限性，通常里面接种的供试品体积不得超过总体积的10%，那简单想一下，如果供试品体积比较大，再加上检验数量有一定的要求，那么需要用大量培养基来进行培养。所以通常来说，样品体积超过100ml就不能使用直接接种法。从上面的分析可以看出，使用直接接种法有很大的局限性。所以药典中规定只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。

封闭式无菌检查方法设计合理，对供试液，冲洗液和培养基的操作全部都是在封闭的环境中进行，在结果的可靠性和可重复性上无疑做得更好，实验结果出现假阳性和假阴性的几率也低得多，而开放式的方法相对操作风险大，所以药典中规定，薄膜过滤法应优先采用封闭式。

无菌检测设备和实验用品因素

和在普通微生物实验室用到的试验用品有所不同，在选择适当的试验物品的时候需要考虑到无菌室的特殊性：不可以影响无菌试验的效果，也不可以对实验室区域的环境造成任何可能的风险。试验用品的材质必须易于清洁而不会脱落颗粒，特别是会接触消毒剂的物品，如剪刀、镊子和盛放消毒剂的容器，不能够被腐蚀。当然，对于实验用品外部材料的选择应该尽量避免使用塑料软袋，物品的灭菌袋子可以选用双层无纺布袋子或者一次性灭菌袋。无菌试验的时候还需要考虑的一个重点就是封闭式无菌检测套筒，许多实验人员也许知道怎么去选择培养基，但是很多人并不了解封闭式无菌检测套筒的工作原理和基本要求：

1．滤膜的完整性：滤膜的完整性需要从两个方面进行考虑，一个是滤膜本身的完整性，一个是滤膜在装配在塑料滤杯后的完整性。前者指的是滤膜表面是否具有不同于标示孔径的微孔的缺陷，主要可以通过对滤膜本身进行起泡点试验来得出最大孔径的数值，如果得出的起泡点试验数据大于或者小于标称数值，那么说明该滤膜本身的孔径是不符合要求的，过大的孔径会造成微生物的漏过，过小的孔径会造成微生物在进行过滤的时候压力过大，造成微生物的损伤，这两种情况都会造成假阴性的结果；后者的情况比较复杂，主要是由于供应商的生产工艺不良造成的，主要表现是滤膜未能装配紧固，造成滤膜和滤杯之间会发生存在空隙，液体在进行过滤的时候会造成样品未能被滤膜截留而从空隙处流入下游。由于微生物未能够被滤膜截留，像这种情况就会造成无菌试验的假阴性。

2．呼吸器的完整性：类似于滤膜的完整性，也必须考虑呼吸器内滤膜的完整性和滤膜装配到呼吸器内后的完整性。不同的是，呼吸器的作用是用于过滤进出无菌检验套筒的气体的，它使用的是0.22μm的疏水性滤膜，它的检验是使用扩散流检测法来证明它的孔径。如果呼吸器的孔径大于0.22μm，或者装配时发生的空隙造成的完整性不佳，会使得呼吸器失去对空气过滤除菌的效果，从而使整个实验过程暴露在试验环境中，将实验发生假阳性的风险大大提高。

3．滤膜的流速测试：如果说滤膜的完整性测试证明了滤膜的最大孔径，但是这一数值不能够表征过滤的效果，那么还需要对滤膜的平均孔径和开孔率的平均效果作一次评估，这个时候就必须在标准温度下使用纯化水进行流速的测试，来保证滤膜的平均孔径和开孔率受控（不会出现滤膜孔径过小和开孔率不够导致过滤压力过大而产生的假阴性）。

4．滤膜的截留率试验：同滤膜的流速测试相对应，还需要了解滤膜的最小孔径的效果会不会过大而影响截留微生物的效率。

5．整套无菌检验套筒的完整性：在整套套筒装配完成之后，还需要对于整套产品进行完整性测试，证明所有的粘合、超声波焊接和热合焊接工艺形成的产品是“封闭式”的，防止有测漏或者破裂的部分导致无菌试验被外来微生物污染从而造成假阳性的影响。

6．无菌性：市场上确实存在由于灭菌条件的不合理或者包装的损坏造成的“非无菌的”无菌检测套筒，因此高标准的灭菌工艺和高质量的包装是合格的无菌检测套筒的必要条件。

7．微生物恢复生长率试验：根据滤膜的种类不同，主要是选择环氧乙烷灭菌或者伽马射线灭菌，但是这不是简单地进行过度灭菌就达到的，因为环氧乙烷灭菌和伽马射线灭菌都会有残留，过度的灭菌会使得无菌检验套筒在进行无菌试验时产生假阴性的结果。因此，合格的无菌检测套筒会在进行无菌试验的同时进行微生物的恢复生长试验，以证明残留的环氧乙烷或者放射性不会对微生物产生明显的影响。

8．耐压试验：通常无菌试验在进行时套筒内气体的体积会被压缩，因此在试验过程中会积累较大的压力，我们也应该考量套筒的耐压性，是否这种套筒在试验过程中较大的压力下能够保证原有的完整性并且不会发生爆裂等影响试验的后果。以上试验应该由使用者进行试验证明或者由生产厂家的质量保证部门在进行过恰当的检验后出具文件证明。

无菌检测培养基因素

应该考虑的可能影响实验结果的因素还包括培养基和冲洗液。可以使用干粉培养基自行配制也可以使用成品培养基和冲洗液。这两者的正确使用与否直接影响到实验的结果。通常会做促生长试验和无菌试验来确认培养基、冲洗液的有效性和无菌性。进行无菌实验室通常还会使用到一些添加剂，尤其是对于抑菌性比较强的样品，会添加一些酶在培养基或者冲洗液中来抑制残留的抗生素。所以，这些添加物也是需要保证有效性和无菌性的，当添加物加入到培养基和冲洗液中时，必须重新对培养基和冲洗液的有效性和无菌性重新进行测试。无菌性，促生长试验结果，pH值和外观通常是需要进行测试的项目。

培养基种类包括中国药典（2010版）中的改良马丁培养基和硫乙醇酸盐培养基FTM，以及EP/USP/中国药典（2015版）中的胰酪大豆胨液体培养基TSB（用于真菌和需气菌的培养）和硫乙醇酸盐培养基FTM（厌氧菌和需气菌培养）。

对于FTM培养基，分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5。

培养基适用性实验的无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。

灵敏度检查：

取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天。

取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支,分别接种小于100CFU的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。

空白对照不生长，接种菌液的培养基，应有明显生长。

缓冲液的作用包括溶解、稀释、润湿滤膜、冲洗。缓冲液无菌性检测的目的是确保冲洗液的无菌性；无菌检查中避免由于实验材料造成假阳性风险。

薄膜过滤方法：过滤之后培养观察14天，没有微生物生长（肉眼判断培养基没有浑浊），冲洗液被认为是无菌的；产品无菌检查同步进行阴性对照。